La
Fertilización In Vitro es la Técnica de Reproducción Asistida en donde la Maduración y Fecundación de los gametos femeninos, así como el desarrollo de los embriones resultantes hasta el estado de blastocisto, se lleva a cabo artificialmente a nivel de laboratorio, para con posterioridad ser congelados o transferidos a una receptora en donde terminará su período de gestación, dando lugar a un nuevo individuo viable.
Este
capítulo estará dirigido a presentar y analizar los diferentes aspectos
relacionados con la especie bovina, su aplicación, desarrollo y avances obtenidos a nivel nacional. En la
actualidad existe un gran número de Profesionales y Compañías de Reproducción
Asistida que ofrecen este servicio, algunas de las cuales han sido citadas en el primer capítulo del
presente Manual De Biotecnología Reproductiva En Bovinos
La
primera cría en bovinos obtenida por FIV fue un ternero nacido el 9-06-1981. (BRACKETT)
Al
igual que la TE, la FIV se ha desarrollado desde el punto de vista
investigativo, requisito previo para su implementación y desenvolvimiento a nivel
comercial, objetivo final como factor de producción, productividad y valor
agregado de la industria ganadera.
En
el aspecto investigativo la FIV permite obtener los conocimientos básicos para
entender el mismo proceso in vitro y poder afrontar otras líneas de
investigación como la criopreservación de gametos y embriones, la transferencia
nuclear y la producción de embriones genéticamente modificados. Igualmente
es posible la evaluación de la capacidad fecundante del
semen y el diseño de diferentes
protocolos de congelación y sexaje del mismo. Es una técnica que facilita la
conservación de especies en vías de extinción.
La
aplicación inicial de la Producción de Embriones In Vitro (PEIV) fue la obtención
de embriones bovinos a gran escala, a
partir de ovarios de donadoras de matadero. Como resultado de la implementación
de técnicas que permiten la recolección
de ovocitos de manera directa de ovarios
de donadoras vivas, se ha podido introducir ampliamente la PEIV en programas de
selección genética en las distintas especies.
La
utilización de la PEIV para la producción comercial de embriones presenta las
siguientes ventajas
1.-
Logra un mejoramiento genético del hato más
ágil en un menor tiempo, acortando el período generacional, utilizando hembras de alta producción y reproductores probados.
2.-
Esta técnica no altera los ciclos reproductivos de la donadora, por lo que no hay necesidad de aplicar gonadotropinas,
evitando efectos secundarios por el empleo de FSH.
3.-
Se logra una mayor cantidad de embriones por donante ya que la aspiración
folicular puede realizarse a intervalos cortos. Igualmente puede ejecutarse en hembras gestantes o poco
después del parto.
4.-
La FIV está indicada en hembras de alta producción que no son
aptas para un proceso de TE convencional, por deformaciones anatómicas que impiden
la fertilización y/o el lavado de los
embriones, como el cuello en S, o que no
responden al tratamiento superovulatorio MOET (Multiovulación y Transferencia de Embriones). Así mismo está
indicada en hembras que han sido eliminadas de la reproducción por afecciones
que no alteran el funcionamiento ovárico, como metritis, complicaciones post
quirúrgicas o lesiones podales, vacas repetidoras (RODRIGUEZ)
5.-
La técnica permite la utilización de semen de toros costosos ya que el número
de embriones producidos por pajilla disminuye los costos del semen. Así una
pajilla es suficiente para 3 a 5 donadoras. De otra parte, cada grupo de ovocitos
se puede inseminar con un toro diferente, lo que aumenta el número de posibles
combinaciones genéticas (MERTON)
6.-
La PEIV permite y facilita la utilización de semen sexado para la producción de hembras con
una eficiencia del 90%. (DAYAN)
Sin
embargo la FIV presenta algunos inconvenientes para el logro de resultados más
satisfactorios.
1.-
A pesar de los esfuerzos realizados para mejorar la eficiencia de la FIV, esta
tiene aún un bajo rendimiento ya que el porcentaje de ovocitos capaces de
transformarse en embriones transferibles está entre el 30 – 40%.
2.-
Los embriones producidos in vitro son de menor calidad que los obtenidos in
vivo, existiendo entre ellos numerosas diferencias.
Los embriones producidos in
vitro son más oscuros y de menor densidad por su mayor contenido citoplasmático
de lípidos. Tienen un menor número de blastómeras, en especial a nivel de la masa celular interna, una zona
pelúcida más frágil, reducción del espacio perivitelino y mayor velocidad de
desarrollo. Además presentan
alteraciones de comunicación intercelular, con una expresión anormal de las
proteínas que forman las uniones Gap, un mayor contenido de triglicéridos y
menor de otros lípidos, alteraciones de la expresión genética, mayor incidencia
de apoptosis.
Lo
anterior reduce su potencial de desarrollo pre y postimplantación, lo cual
origina bajos porcentajes de gestación (30-40%). (HERRADON)
3.- Existe una mayor divergencia
en el desarrollo de los embriones obtenidos in vitro respecto de los obtenidos in vivo,
ya que los segundos dependen del momento de la ovulación y la fecundación, sin
embargo, en el modelo in vitro el momento de la fecundación es más preciso y
por lo tanto tiene una mayor sincronización (PALMA)
4.-
Los embriones in vitro tienen menor resistencia a la criopreservación, siendo uno de sus principales
problemas, ya que la supervivencia después del congelamiento es menor que el de
los embriones producidos in vivo, lo cual dificulta su conservación a largo
plazo. Por lo tanto, estos embriones son transferidos preferiblemente en
fresco, lo cual requiere de la sincronización de las receptoras con la
producción de embriones. (COLAZO)
En
el Gráfico 1 se aprecia la tendencia de
la PEIV a nivel mundial.
La TEs producida por FIV en 2011 en Sur América fue de 373.836, siendo el Brasil el país en donde se logró el mayor número de TE-FIV 318.119, representando el 85% del total. En Colombia se lograron 30.000 TE-FIV, con un crecimiento del 900% en 10 años. (GOMEZ)
La TEs producida por FIV en 2011 en Sur América fue de 373.836, siendo el Brasil el país en donde se logró el mayor número de TE-FIV 318.119, representando el 85% del total. En Colombia se lograron 30.000 TE-FIV, con un crecimiento del 900% en 10 años. (GOMEZ)
A pesar de las limitaciones de la técnica, Brasil ha mostrado un fuerte impulso para reemplazar la TE por OPU / PIV. Esto se debe a una peculiaridad del ganado cebú (Bos indicus), dado que las vacas suelen tener más folículos ováricos y más ovocitos recuperados por OPU en comparación con el ganado Bos taurus.(PONTES)
No hay ninguna explicación aparente para esta diferencia biológica intrigante. Sin embargo, la información disponible en la mayoría de OPU/PIV en Brasil se obtuvo en Nelore, responsable de aproximadamente el 80% del rebaño brasileño (cerca de 200 millones de animales) Las razas cebuínas siguen representando la mayoría de los embriones producidos en Brasil, con 94,0% del total. (PONTES).
Según
ASOCEBU durante 2012 se incrementó el Fertilizaciones In Vitro, para un total
de 4367. Para 2012, el incremento de la Transferencia de Embriones fue de un
3.52% frente a 2011, reportándose 4112 lavados al finalizar el año, de los
cuales 906 fueron embriones frescos, 3113 In Vitro y 93 congelados. (Revista “El
Cebu” 391 Marzo-Abril 2013)
En
la Tabla 2 se pueda apreciar cual ha
sido la Evolución de la TE-FIV en Colombia de 2.008 a
2.012 en donde se ha logrado un mejoramiento efectivo del 9.6% en el porcentaje
de preñez, en 5
años. (GOMEZ 2013)
TECNICA DE
PRODUCCION DE EMBRIONES
IN VITRO - PEIV -
La
PEIV es un método importante en el avance de áreas de investigación cuya
principal limitante es el alto costo de la producción convencional de embriones. Desde el punto de vista
comercial se emplea para acelerar la producción de animales genéticamente
superiores. Comprende para su realización
de los siguientes pasos:
1.- Recolección de ovocitos.
2.- Selección de ovocitos
3.- Transporte y Maduración de
ovocitos
4.- Capacitación Espermática.
5.- Fertilización Gamética
6.- Selección de Embriones.
7.- Transplante de Embriones
RECOLECCION DE OVOCITOS
La
recolección de ovocitos puede realizarse a partir ovarios de hembras de matadero o en donadoras vivas mediante procedimientos quirúrgicos,
laparoscopicos o Aspiración Folicular Transvaginal (OPU).
RECOLECCION A PARTIR HEMBRAS DE MATADERO
La
obtención de ovarios de hembras de matadero es la forma más común y económica para la recolección de
ovocitos con fines experimentales del proceso de FIV. Es el método que ha
permitido el desarrollo de la producción in vitro de embriones bovinos y la que
dio comienzo a la producción de embriones a gran escala.
OBTENCION Y TRANSPORTE DE LOS OVARIOS
Los ovarios deben ser obtenidos enseguida del sangrado de los animales,
efectuándose un primer lavado con solución salina, para eliminar la sangre y
adherencias. El transporte puede hacerse en solución salina o PBS con
antibióticos a temperatura ambiente.
Yang y col. Fueron los primeros en estudiar el tiempo de conservación de los ovarios a 24-25°C. Los autores observaron que el transporte de los ovarios durante 11 horas no disminuyó la vitalidad de los oocitos obtenidos, lo cual constituye un aspecto práctico importante al permitir el procesamiento de material recolectado a grandes distancias.
Sin embargo las temperaturas ambientales entre 30°C y 35°C alteran el tiempo de procesamiento el cual debe hacerse dentro de las 2 horas de su obtención. Cuando los ovarios se conservan durante 24 horas a 21°C, 18°C y 15°C los porcentajes de división y de blastocistos no fueron diferentes del grupo a 25°C durante 4 horas. La refrigeración de los ovarios a 4°C durante 12 – 24 horas no afectó la tasa de división. (PALMA)
La
técnica de disección consiste en efectuar varios cortes en el estroma ovárico y mediante presión del mismo producir la expulsión de los ovocitos.
En El Gráfico 3 se presenta
el comportamiento de
OPU en las diferentes razas
bovinas en Colombia.
Se introduce el transductor dentro de la vagina, hasta el fornix vaginal, ubicando la cabeza del mismo en el lado del ovario a puncionar. Luego se introduce la mano izquierda por el recto y se retrae el ovario, fijándolo contra la cabeza del transductor.
Luego de ubicar el ovario a aspirar, se impulsa la aguja suavemente para que penetre la pared vaginal y la folicular.
Una vez logrado esto la bomba de vacío aspira el contenido y lo deposita en el filtro de embriones o en el recipiente destinado para tal fin. En cualquiera de los casos estos deben contener medio de aspiración heparinizado (PBS+10% de suero fetal bovino).
En la pantalla del ecógrafo podemos ubicar y visualizar los folículos, así como apreciar la trayectoria de la aguja, la aspiración del contenido folicular, la reducción del espacio ocupado por folículo y el éxito de la aspiración
Luego de completar la aspiración de los folículos en cada uno de los ovarios, los ovocitos son depositados en un recipiente con medio de cultivo para con posterioridad ser seleccionados con el fin de iniciar el proceso de maduración.
SELECCION DE OVOCITOS
Grado I (GI) - Cumulus compacto, que contiene más de tres capas de células. Ooplasma con
granulaciones finas y
homogéneas, que llenan el interior de la zona pelúcida y capa de color marrón.
Grado II (GII) - Cumulus compacto que rodea completamente el ovocito, con menos de tres capas de células. Ooplasma con granulaciones distribuidas heterogéneamente, que pueden estar más concentradas en el centro y más claro en la periferia o condensadas en un solo lugar en donde se ve una mancha oscura.
Tabla 6
La
maduración nuclear y citoplasmática debe ocurrir simultáneamente confiriéndole
a los ovocitos la capacidad de ser
fecundados además de poder descondensar la cabeza del espermatozoide, formar
los pronúcleos y el desarrollo normal
del embrión.
Los
eventos nucleares consisten en la reorganización de la red de microtubulos,
rompimiento de del envoltorio
nuclear, descondensación de los
cromosomas y progresión a la Metafase I, Anafase I, Telofase I, expulsión del
primer cuerpo polar hasta llegar al estado
de Metafase II.
En
cuanto al citoplasma, ocurre la
reprogramación de la síntesis proteica,
así como la activación de la proteinquinasa por los Mitógenos (MAPK) y el
Factor Promotor de la Maduración (MPF).
Igualmente se desencadenan los mecanismos de liberación de Ca++ y la adquisición de la capacidad de decondensar la
cabeza del espermatozoide.
OBTENCION Y TRANSPORTE DE LOS OVARIOS
Yang y col. Fueron los primeros en estudiar el tiempo de conservación de los ovarios a 24-25°C. Los autores observaron que el transporte de los ovarios durante 11 horas no disminuyó la vitalidad de los oocitos obtenidos, lo cual constituye un aspecto práctico importante al permitir el procesamiento de material recolectado a grandes distancias.
Sin embargo las temperaturas ambientales entre 30°C y 35°C alteran el tiempo de procesamiento el cual debe hacerse dentro de las 2 horas de su obtención. Cuando los ovarios se conservan durante 24 horas a 21°C, 18°C y 15°C los porcentajes de división y de blastocistos no fueron diferentes del grupo a 25°C durante 4 horas. La refrigeración de los ovarios a 4°C durante 12 – 24 horas no afectó la tasa de división. (PALMA)
Una
vez llegan los ovarios al laboratorio deben procesarse en condiciones asépticas
y bajo una cámara de flujo laminar. Se lavan 3 veces en medio de
transporte, se secan con gasa o papel
absorbente estéril, se depositan en
recipientes térmicos que contienen solución salina o PBS con antibióticos (Penicilina
G sódica 100 UI/ml + 100 g/ml de Sulfato de Estreptomicina) y se procede a la
obtención de los ovocitos para el proceso de FIV. (REA)
La recolección se
efectúa mediante disección o cortes ováricos (SLICING) y aspiración de los folículos.
TECNICA DE
DISECCION
La
técnica de disección consiste en efectuar varios cortes en el estroma ovárico y mediante presión del mismo producir la expulsión de los ovocitos.
Tiene la ventaja de permitir el aislamiento individual de
los folículos determinando su tamaño antes de la recolección de todos los ovocitos,
con el fin de asegurar la máxima
recuperación de ovocitos competentes, de
cualquier donadora. (GALLI)
TECNICA DE
ASPIRACION FOLICULAR
La
técnica de aspiración de los folículos se realiza por medio de jeringas con aguja N°18. Se introduce la aguja con el bisel hacia arriba dentro el estroma
ovárico, dirigiendo la punta hasta penetrar el interior del folículo, efectuando
enseguida la aspiración tanto del líquido folicular como del ovocito.
Al
efectuar la aspiración se aprecia la reducción de las paredes del folículo.
Sin
retirar la aguja del ovario se busca un nuevo folículo para aspirarlo. Se aspiran folículos entre 2 a 6 mm de
diámetro. Los ovocitos de folículos bovinos con un diámetro menor se encuentran
todavía en fase de crecimiento y no han adquirido aun la capacidad para
madurar. De otra parte los ovocitos provenientes de folículos de más de 10 mm
presentan un mayor número de ovocitos degenerados. (GONZALEZ)
Los
ovocitos aspirados son depositados en un tubo de ensayo, dejándolos en reposo
durante 30 minutos, en incubadora a 39°C, 5% de CO2 y 100% de humedad, con el
fin de favorecer la precipitación del sedimento compuesto por ovocitos, células
de descamación, sangre. Con posterioridad se aspira el sedimento con una pipeta
y se coloca en una caja de Petri con medio TCM 199 temperado, para la
correspondiente selección bajo el estereoscopio.
RECOLECCION DE
OVOCITOS EN ANIMALES
VIVOS
La
recolección de ovocitos en animales vivos se puede efectuar
mediante métodos quirúrgicos como ovariectomía transvaginal o paralumbar, laparotomía ventral o paralumbar, laparoscopia
abdominal, métodos invasivos y costosos que dejan secuelas como las
adherencias. Igualmente puede efectuarse la Aspiración Folicular Dirigida por Ecógrafo.
OVARIECTOMIA
La
ovariectomía puede efectuarse por vía transvaginal utilizando un bisturí de
Dutto y un dilatador vaginal. Se realiza una colpotomía dorsal del fornix
vaginal y se extraen ambos ovarios con el ovariotomo. (ALLER). Sin embargo el
riesgo de peritonitis y evisceración a través de la incisión vaginal han
limitado y restringido este procedimiento. Igualmente puede efectuarse por
laparotomía paralumbar y extracción con el ovariotomo, proceso similar a la
castración de hembras.
LAPAROSCOPIA
Mediante
anestesia general se prepara la hembra y
se localizan los puntos de penetración del equipo de laparoscopía, por
delante del tendón prepubico y por detrás del ombligo. Con la fuente de luz se
localizan los ovarios y se fijan alternativamente con la pinza caimán. Luego se
punciona y aspira el folículo por medio del aspirador conectado al tubo
recolector.
Por
lo general se somete la hembra a un
proceso previo de superovulación, con el fin de obtener un mayor número de ovocitos aptos, así como facilitar la
aspiración por el tamaño de los folículos. (DE LA FUENTE)
ASPIRACION
FOLICULAR TRANSVAGINAL - OPU -
Es
la técnica por medio de la cual se recolectan ovocitos de folículos en ovarios de hembras vivas, utilizando la aspiración guiada por ecografía a través de la pared del fornix
vaginal. Se considera una adaptación de la técnica empleada en humanos. Es más conocida como Ovum Pick Up –OPU-
por sus siglas en ingles.
En
la actualidad es la técnica utilizada regularmente en el proceso de PEIV en bovinos. La técnica de la OPU tiene la ventaja
de ser sencilla y fácil de efectuar, además de permitir
la recolección de ovocitos en series
repetidas para procedimientos in vitro, con un aumento en el número de
folículos luego de varias semanas de aspiración folicular.
La eficacia del procedimiento
de aspiración folicular transvaginal está directamente relacionada con una
metodología adecuada, dado que las variables técnicas para obtener los ovocitos
pueden tener un impacto considerable en la cantidad y la morfología del cumulus
oophorus (CCOs), y en consecuencia, sobre la capacidad para desarrollarse.
Otro aspecto se relaciona con
el tipo o raza de la donante, teniendo en cuenta su condición corporal y la
edad.
En relación con la raza se ha encontrado una peculiaridad en el ganado Bos indicus en el que las hembras suelen tener un mayor número de
folículos ováricos y ovocitos recuperados por OPU, en comparación con el ganado Bos taurus. Sin embargo, no hay una explicación aparente para esta diferencia
biológica intrigante. (PONTES)
Hay
un constante incremento en la participación de las razas lecheras en el mercado
de embriones, especialmente el Gyr (68,0% del total) y Gyrholando (22,4%), la
única raza compuesta con una importante participación tanto en la TE como
en la PIV (VIANA).
El
interés por las razas cebuínas lecheras se debe a su capacidad de adaptación
para producir grandes cantidades de leche bajo condiciones de estrés tales como
altas temperaturas, parásitos y pastos pobres. El incremento del método de la
PIV en donantes Gyrholando se ha debido
al aumento de la eficiencia del uso de semen sexado para la fertilización in
vitro, lo que facilita la producción de un gran número de hembras para la
industria láctea. (XU)
GOMEZ.
Es
notorio y sin explicación alguna cómo
ciertas hembras han producido cientos de
ovocitos en un solo procedimiento OPU, sin ningún tipo de estímulo. SENEDA
obtuvo 251 ovocitos por una sola vez, al igual que otros profesionales, lo cual
indica la existencia de una variación individual en la producción de ovocitos
de donantes Bos indicus, en donde el
Nelore presenta una especial característica solo en la producción de embriones
in vitro. (RAFAGNIN)
En
la Tabla 3 se muestra los
resultados obtenidos por el Dr Ramón Gomez, lo cual corrobora lo expuesto en
tal sentido por otros autores.
Aunque las hembras Nelore tengan mayor número de folículos reclutados, los parámetros reproductivos pueden variar ampliamente entre los animales de la misma raza, o incluso entre gemelos monocigóticos. (MACHADO)
Hay
animales con un buen potencial para la OPU/PIV, debido a que presentaN de forma
natural muy altos promedios de ovocitos y por consiguiente buen número de
embriones y preñeces. Muchos criadores han identificado hembras cuya progenie
es muy buscada y fácilmente vendible, por lo tanto esas hembras son usadas exclusivamente
para PEIV.
En la Tabla 4 se
puede observar el desenvolvimiento de la vaca
118/2 durante los años 2008-2012 en un programa de
PEIF. (GOMEZ)
Con referencia a la edad, en las hembras prepuberes los
ovocitos han demostrado una gran reducción de desarrollo al estado de
blastocisto debido a la poca influencia de las gonadotropinas en este período,
de otra parte las hembras viejas producen ovocitos con bajo porcentaje de
desen arrollo y de baja calidad debido a las pocas capas de las células del cúmulo.
Puesto
que los ovarios de hembras gestantes mantienen su actividad durante la preñez,
es posible la recuperación de los ovocitos
hasta el día 100 de gestación o hasta el momento en que el profesional pueda
retraer los ovarios sin mayor esfuerzo. Igualmente está indicada en hembras de
alta producción con problemas
reproductivos no ováricos como alteraciones de tipo anatómico del tracto
reproductivo, afecciones podales y/o hembras repetidoras.
Por
lo anterior desde el punto de vista práctico y comercial, las hembras a aspirar
deben ser jóvenes, hijas de vacas de
alta producción o hembras adultas con registros actualizados, en su pico de
producción.
De otra parte hay consenso
sobre la Condición Corporal (CC), en la que las donantes con baja CC
producen ovocitos con
menos capacidad para
desarrollarse al estado
de blastocisto, y hay
evidencias de que
las donantes sometidas a
estrés tendrían ovocitos menos
competentes.
La
técnica de OPU es
un procedimiento minimamente invasivo que
permite la recolección de ovocitos en sesiones repetidas a intervalos de 7 a 15
días, con lo cual se logra un mayor número de embriones por animal año, que por
TE convencional.
Existen
estudios que sugieren diferentes días del ciclo estral para realizar la OPU (días 3-4, 9-10, 15-16 después del
estro) y a diferentes intervalos de una o dos veces a la semana.
MERTON
et al sugiere que la mejor tasa de recuperación
se presenta cuando el intervalo entre punciones es de 7 días, al compararlo
con protocolos que utilizan intervalos de 3 o 4
días.
En
un trabajo realizado por MOREIRA y col,
se realizó la recolección de ovocitos mediante OPU a intervalos de una vez por
semana (Grupo 1) y dos veces a la semana (Grupo 2). No hubo diferencia
significativa entre los grupos G1 y G2. Los folículos >9 mm se observaron durante
todos los intervalos considerados entre aspiraciones (3-4 o 7 días). Se recolectaron más ovocitos por
sesión en el G1. La recolección de COCs Grado I fue mayor en el G2. No hubo
diferencia en la tasa de clivaje entre los grupos, pero el porcentaje de
embriones que alcanzaron el estado de blastocisto fue mayor en el G2. La mayor
calidad de los ovocitos del G2 fue compensada por la mayor tasa de recuperación
del G1.
GALLI
et al observaron que la OPU realizada dos veces a la semana, producía el mayor
número de ovocitos recolectados con
la calidad adecuada para la PIV.
La competencia de los ovocitos
obtenidos por aspiración folicular transvaginal no parece estar influenciada
por el tamaño del folículo, sin embargo se ha demostrado que la tasa de
recuperación es más alta significativamente para los folículos inferiores o
iguales a 4 mm. La tasa de recuperación es el número de
ovocitos recuperados tras la punción de 100 folículos y ha demostrado que los
folículos menores permiten la más eficiente recuperación ovocitaria
Como una estrategia para
mejorar la relación costo-beneficio en los programas de PIVE, los donantes
pueden clasificarse como adecuada cuando la ecografía de los ovarios muestra de
manera satisfactoria la población de folículos con un diámetro superior a 3 mm (SENEDA).
Entre un 50 y 70% de los ovocitos obtenidos son aptos para la
fertilización in vitro, alrededor del 90% de estos son fertilizados y
entre el 20 y 40% alcanzan el estado de blastocisto. Por lo tanto, mantener una fuente constante de
ovocitos de alta capacidad de desarrollo, alto valor genético y máxima calidad
sanitaria es uno de los puntos claves para garantizar un sistema comercial de
producción in vitro de embriones. (NAVA)
La tasa de preñez se
encuentra alrededor del 50% para los embriones en fresco y cerca del 40% para
embriones congelados, siendo la tasa de nacimientos menor en un 5-10% que la
tasa de preñez. Estos resultados varían ampliamente en los diferentes
programas de FIV. (WAGTENDONK-de LEEUW)
Algunos profesionales han implementado la compra de ovocitos aspirados de novillas de matadero, provenientes de ganaderías de alta
producción, eliminadas con la finalidad de mantener la capacidad de carga de la explotación, las cuales se destinan
a la producción y congelación de embriones por FIV.
La
punción continua, dos veces a la semana, tiene una gran influencia sobre el
ciclo estral, al modificar la función endocrina y los mecanismos de crecimiento
folicular, lo que conduce a que se presenten intervalos irregulares o ausencia
de estros. Las punciones en sesiones frecuentes pueden dar lugar a una
disfunción o ausencia del CL y a una producción inadecuada de Progesterona. TAKENOUCHI et al sugieren que si la OPU se limita a
los días 0 y 12 del ciclo, la influencia de la dinámica folicular puede
disminuirse o eliminarse. BAGE et al afirman que en protocolo de dos veces a la
semana, limitados a la primera mitad del ciclo estral, en novillas, estas presentan intervalos estrales
normales. (PFEIFER)
Se
ha demostrado que la perforación del fornix vaginal cura rápidamente y solo en
pocas oportunidades se presentan inflamaciones o procesos infecciosos del
tracto genital. Puede desarrollarse en algunos casos hematomas en la región perivaginal, no siendo un
problema grave para la donante. La punción de los ovarios puede dar lugar a
fibrosis o adherencias, en especial en vacas sometidas a aspiraciones seriadas
en períodos cortos, igualmente se ha observado mineralización del folículo o
del parénquima ovárico, así como engrosamiento del epitelio ovárico, lo cual da
lugar a una disminución de la actividad ovárica. El riesgo de secuelas
consecutivas a la OPU existe y debe tenerse en cuenta, por lo que el procedimiento debe realizarse de
manera cuidadosa.
Por
lo anterior, al igual que en todas las técnicas de reproducción asistida, es
importante que el profesional tenga
bases firmes sobre anatomía y fisiología reproductiva, al igual que la
habilidad necesaria para la correcta
identificación del tracto genital y las estructuras funcionales del ovario,
tanto por palpación como por ecografía. Juega un papel muy importante el criterio y la
experiencia del profesional en la escogencia del protocolo a seguir teniendo en cuenta las
distintas variables tanto generales como individuales, al seleccionar la
donante y evaluar su capacidad de producción de
ovocitos, al momento de la OPU, para que se puedan lograr resultados
satisfactorios.
TECNICA OPU
Para
llevar a cabo la técnica de aspiración folicular in vivo se requiere
contar con un equipo de ecografía, un transductor sectorial, una bomba de
aspiración controlable y un sistema guía
de la aguja.
El
transductor lineal es sin duda el más utilizado en reproducción de animales
grandes. La principal desventaja de su utilización en OPU, se refiere al
limitado espacio entre el transductor y la aguja, lo que impide que sean puncionadas todas las regiones del ovario, así como el cambio de posición de los ovarios.
En
la actualidad se utiliza el transductor
convexo o sectorial, por su versatilidad, facilidad y eficiencia en la fijación y el cambio de posición del ovario, así como
una mejor apreciación de folículos pequeños en comparación con el transductor
lineal. La sonda ecográfica para OPU ha sido adaptada para permitir la fijación
y manipulación del ovario, de tal manera que este en contacto estrecho con el
transductor y a su vez permita que la punta de la aguja pueda visualizarse
cuando penetra dentro del folículo a ser aspirado.
Para
la aspiración se emplean agujas hipodérmicas desechables de calibre 18 - 19 y 40 - 50 mm de longitud. Las agujas con
calibres superiores a 18 están relacionadas con mayores tasas de recuperación,
pero con un porcentaje mayor de ovocitos desnudos, así como importantes daños
al estroma y una mayor cantidad de sangre en el líquido aspirado. Las agujas de
diámetro inferior a 18 han reducido las tasas de recuperación de ovocitos,
posiblemente por la lentitud de la aspiración del líquido folicular en el
momento de la punción.
Contrario
a las expectativas sobre que el bisel corto sería más eficiente, más fácil y
rápido de introducir en el interior del folículo, se ha reportado una mayor recuperación y calidad de los
ovocitos cuando se utilizaron agujas con bisel largo. La razón sería que el
corte del bisel largo permite una superficie más amplia de la
punta de la aguja lo que facilita la penetración dentro del folículo y evita la
posibilidad de fuga del contenido folicular.
(SENEDA)
La frecuencia del transductor
es una variable importante en el proceso de recolección de ovocitos [26]. Hay
citas de 3,5 MHz de frecuencia [8], de 7,5 MHz [27, 47], 5,0 MHz [1,16,41] y
6,5 MHz [28,45].
En primer
lugar, al iniciar el trabajo, las hembras a aspirar deben sedarse con xilazina
y además recibir anestesia epidural con lidocaina al 2% (3-5 ml/vaca). Luego se procede a limpiar y desinfectar la vulva y el
periné.
Una vez
realizada la limpieza y desinfección del tren posterior, se procede a armar el portaguja en la
guía y se acopla el transductor al sistema. Una vez acoplado se protege con una
funda plástica que puede ser un guante desechable.
Se introduce el transductor dentro de la vagina, hasta el fornix vaginal, ubicando la cabeza del mismo en el lado del ovario a puncionar. Luego se introduce la mano izquierda por el recto y se retrae el ovario, fijándolo contra la cabeza del transductor.
Luego de ubicar el ovario a aspirar, se impulsa la aguja suavemente para que penetre la pared vaginal y la folicular.
Una vez logrado esto la bomba de vacío aspira el contenido y lo deposita en el filtro de embriones o en el recipiente destinado para tal fin. En cualquiera de los casos estos deben contener medio de aspiración heparinizado (PBS+10% de suero fetal bovino).
En la pantalla del ecógrafo podemos ubicar y visualizar los folículos, así como apreciar la trayectoria de la aguja, la aspiración del contenido folicular, la reducción del espacio ocupado por folículo y el éxito de la aspiración
Luego de completar la aspiración de los folículos en cada uno de los ovarios, los ovocitos son depositados en un recipiente con medio de cultivo para con posterioridad ser seleccionados con el fin de iniciar el proceso de maduración.
MEDIOS DE CULTIVO
Para que se efectúen a nivel de laboratorio las diferentes etapas de desarrollo y fertilización del ovocito, así como el crecimiento del embrión y su capacidad de ser transferido, es necesario contar con medios de cultivo celular adecuados, cuyos requerimientos fisiológicos para el mantenimiento y desarrollo de los embriones son fundamentales y sus márgenes de variación reducidos.
Inicialmente estos medios eran elaborados por los profesionales en Centros de Reproducción Asistida, con lo cual se incrementaban los costos y la inestabilidad de los mismos, dada la complejidad de su preparación y el equipo necesario para su elaboración..
Inicialmente estos medios eran elaborados por los profesionales en Centros de Reproducción Asistida, con lo cual se incrementaban los costos y la inestabilidad de los mismos, dada la complejidad de su preparación y el equipo necesario para su elaboración..
En la actualidad diferentes casas comerciales producen y distribuyen los medios básicos de cultivo, los que pueden restituirse poco antes de ser utilizados o ser refrigerados y almacenados por periodos variables, según el caso. Estos medios varían desde los muy simples a los muy complejos, que en general contienen en sustancias como:
1.- Iones inorgánicos cuyas funciones son catalíticas y fisiológicas.
2.- Fuentes de energía como el lactato, piruvato y glucosa.
3.- Aminoácidos que intervienen en la síntesis proteica. Sirven como fuente de energía, como tampones intracelulares del pH y reguladores del desarrollo embrionario.
4.- Vitaminas que juegan un papel importante en el metabolismo de los hidratos de carbono y los aminoácidos, como coenzimas.
5.- Elementos orgánicos como fuente adicional de proteínas. Entre estos tenemos el
Suero Bovino (SB) y la Albumina Sérica Bovina (BAS)
Su calidad y composición química depende del tipo y estado del donante:
Suero Fetal Bovino (SFB).
Suero de ternero recién nacido.
Suero de novillo.
Suero de vaca en celo (SVC).
Suero Fetal Bovino (SFB).
Suero de ternero recién nacido.
Suero de novillo.
Suero de vaca en celo (SVC).
Los efectos benéficos de la adición del suero o la albúmina son:
Protección de los embriones en cultivo de sustancias toxicas como los metales pesados
Aportar Hormonas y Factores de Crecimiento.
Reducción de la tensión superficial del medio, evitando que los embriones se adhieran a los dispositivos como placas de cultivo, pipetas, tubos etc. (MUCCI)
Protección de los embriones en cultivo de sustancias toxicas como los metales pesados
Aportar Hormonas y Factores de Crecimiento.
Reducción de la tensión superficial del medio, evitando que los embriones se adhieran a los dispositivos como placas de cultivo, pipetas, tubos etc. (MUCCI)
6.- Hormonas que inciden notoriamente en el desarrollo embrionario, siendo benéficas sobre el complejo cúmulo-ovocito completando la maduración meiótica. Diversos autores han adicionado hormonas como LH, FSH y 17β Estradiol a los medios de maduración y desarrollo de los ovocitos, con el fin de lograr un mayor número de embriones transferibles. Recientemente se ha empleado como sustitutos de ellas el Líquido Folicular (LFb) y el Fluido Oviductal Sintético modificado (SOFm). El LFb contiene esteroides, glucosaminoglicanos y metabolitos sintetizados por las células de la teca folicular.
7.- Antibióticos. Simultáneamente los medios de cultivo son complementados con antibióticos con el fin de suprimir el crecimiento de microorganismos contaminantes.
Otros requisitos del medio de cultivo están relacionados con:
Agua = Se emplea como diluyente de los componentes del medio, recomendándose la utilización de agua Bidestilada (BD) o tridestilada. Actualmente se emplea el sistema de purificación mediante osmosis reversa. Su grado de pureza está fuertemente relacionada con el desarrollo embrionario.
pH = El pH debe estar entre 7.2 y 7.4 para cultivo, mientras que para el medio de fecundación se recomienda un pH superior 7.6 – 7.8.
Osmolaridad = La osmolaridad óptima en el medio de cultivo debe estar entre 275 y 285 mOsm.
Dióxido de carbono (CO2) y tensión de Oxígeno (O2) = Las condiciones habituales para la maduración y fertilización del ovocito son 5% de CO2 y 95% de aire. El CO2 es necesario para la regulación del pH intracelular. Para el desarrollo embrionario CO2 5%, O 5%, N 90%
Temperatura = La temperatura de cultivo utilizada en general por los investigadores es de 38.5°C con 100% de humedad.
Conservación = Almacenamiento en refrigeración entre 2 – 6°C
Signos de alteración = Cambios de coloración
Presencia de grumos o precipitado
Insolubilidad
SELECCION DE OVOCITOS
El
desarrollo in vitro de los ovocitos está íntimamente relacionado con la aptitud
que adquieren durante su etapa folicular previa. El folículo es una estructura
ovárica con dos funciones, producción de hormonas y de ovocitos aptos para ser
fecundados. Las mismas son llevadas a cabo por los folículos antrales, los
cuales poseen una pared interna de células de la granulosa que se apoyan sobre
la membrana basal. Esta matriz extracelular separa las capas epiteliales del
mesénquima y afecta la migración celular, proliferación y diferenciación de las
células que se apoyan en ella.
La selección de los ovocitos se realiza generalmente en base a
tres criterios: el diámetro del ovocito, el aspecto de su citoplasma y las
características del cúmulo que los rodea. El diámetro de los ovocitos
condiciona su capacidad para madurar de
tal forma que los ovocitos bovinos con un diámetro inferior a 110 μm se
encuentran todavía en fase de crecimiento y no han adquirido aun la capacidad
para madurar.
Los ovocitos rodeados por un cúmulo compacto formado por varias
capas de células, presentan mayores porcentajes de maduración, fecundación y desarrollo hasta blastocistos, que los que
carecen de cúmulo o los que están rodeados solamente por la corona radiada.
Diversos autores han tratado
de establecer una relación entre el aspecto del citoplasma y la competencia del
ovocito para madurar, ser fecundado y soportar el desarrollo posterior. Así, se ha comprobado que los ovocitos que presentan un
ooplasma oscuro muestran una acumulación de lípidos y un buen potencial para el
desarrollo, mientras que los que presentan un citoplasma pálido tienen una baja
densidad de orgánulos y escaso potencial de desarrollo. Por otra parte, cuando
el ooplasma es negro, los ovocitos están envejecidos y tienen un potencial muy
bajo para soportar el desarrollo (Nagano et al., 2006) (HERRADON)
El
potencial de maduración, fecundación y capacidad de desarrollo embrionario de los
ovocitos se puede estimar por la aparición de células del Complejo Cumulus Oophorus (COC), con la siguiente clasificación.
Grado I (GI) - Cumulus compacto, que contiene más de tres capas de células. Ooplasma con
granulaciones finas y
homogéneas, que llenan el interior de la zona pelúcida y capa de color marrón.Grado II (GII) - Cumulus compacto que rodea completamente el ovocito, con menos de tres capas de células. Ooplasma con granulaciones distribuidas heterogéneamente, que pueden estar más concentradas en el centro y más claro en la periferia o condensadas en un solo lugar en donde se ve una mancha oscura.
Grado III
(GIII) – Oopplasma contraído, con espacio entre la membrana
celular y la zona pelúcida, llenando el espacio perivitelino de manera
irregular.
En este grupo se encuentran:
Desnudo - No cubiertos por
células del cúmulo o cubiertos en parte por ellas.
Degenerado – Con citoplasma heterogéneo, vacuolizado o fragmentado.
Atrésico - Cumulus
oophorus oscuro o con presencia de signos de degeneración citoplasmática. (RAFAGNIN)
MADURACION DE OVOCITOS MIV
Una vez seleccionados los ovocitos son colocados en un medio de maduración e incubados durante 24 horas en un ambiente de alta humedad, 5% de CO2 y protegidos de la luz. Una vez trascurridas las 24 horas de la MIV, los ovocitos maduros (MII), están preparados para su fecundación
Los
ovocitos una vez retirados de los
ovarios, no están aptos aún para ser
fecundados e iniciar el desarrollo embrionario inicial, por lo que es necesario
que sufran una serie de modificaciones
estructurales y bioquímicas en el Núcleo (Maduración Nuclear) y en el Citoplasma (Maduración Citoplasmática) para poder adquirir la capacidad de ser
fecundados, lo que en conjunto se denomina Maduración Ovocitaria.
La maduración del ovocito es la última de
una serie de etapas que debe atravesar una célula germinal femenina para
adquirir la capacidad de ser fecundada y dar origen a un nuevo individuo.
Durante esta última etapa el ovocito sufre profundos cambios a nivel nuclear y
citoplasmáticos que son regulados paracrinamente por una compleja comunicación
bidireccional con las células somáticas que lo rodean. Esta regulación local es
coordinada por factores endocrinos que son secretados en forma cíclica. Como
resultado de la interacción entre los diferentes niveles de regulación, paracrina
y endocrina, solo unos pocos ovocitos son seleccionados para iniciar la etapa
de maduración a lo largo de la vida fértil, mientras que la mayor parte
degeneran en atresia. Al final de la etapa de maduración ocurre la ovulación, y
el ovocito es, durante un corto período de tiempo, una célula completamente
competente capaz de dar origen a un nuevo individuo si es fecundada en un momento
determinado. (LATTANZI)
Existe una relación
entre el diámetro del folículo y el desarrollo del
ovocito y su capacidad de desarrollo in
vitro. Así ovocitos procedentes de folículos pequeños (1-2 mm) logran la
maduración nuclear pero son inmaduros citoplasmáticamente. De otra parte ovocitos procedentes de folículos medianos (2-5 mm) o grandes (5-8mm) tienen un
mayor porcentaje de lograr la maduración nuclear y alcanzar el estado de
blastocisto. La competencia meiótica aparece cuando el ovocito alcanza el 80-90% de su tamaño,
pero hasta, que no alcanza su tamaño
máximo no puede completar la maduración citoplasmática.
La tasa de
maduración nuclear aumenta con el diámetro del ovocito, lo que sugiere que los
ovocitos con diámetro inferior a 110 µm están aún efectuando la síntesis de ARN
y por consiguiente todavía se encuentran en fase de crecimiento y por
consiguiente no han completado la maduración nuclear y citoplasmática en el momento de la FIV. Cuando
el diámetro ovocitario supera los 110 µm la mayoría de los ovocitos se
desarrollan hasta MII. (GONZALEZ)
Tabla 6
Se aprecia
la relación existente entre el tamaño del
folículo y el ovocito y su capacidad
para alcanzar su
desarrollo a MII
Además durante este período ocurren
cambios en la reorganización del citoplasma
tales como el desarrollo continuo de los niveles lipídicos, reducción
del aparato de Golgi, aparición de los ribosomas adyacentes a los cromosomas, migración de las
mitocondrias y alineamiento de los gránulos corticales próximos a la membrana
plasmática. El aumento de los niveles lipídicos está asociado a la formación de
un pool de energético esencial para que el ovocito pueda
desarrollarse después de
la fecundación.
Otro evento que ocurre durante la maduración ovocitaria es la expansión de
las células del cúmulo que circundan al ovocito, las cuales son células
especializadas de la granulosa asociadas metabólicamente entre sí y con el
ovocito. Las proyecciones de las células del cúmulo atraviesan la Zona Pelúcida
y forman pequeñas uniones con el ovocito. Estas uniones son la única entrada de
sustancias que estimulan el plasma. En el ovocito inmaduro estas células están
muy compactas y durante la maduración se inicia la secreción de ácido
hialurónico, el cual se deposita entre
ellas separándolas y originando su
expansión.
Todos estos eventos que tienen lugar normalmente en el animal, deben llevarse a cabo a nivel de laboratorio durante el proceso de Maduración IV.
La expansión de las células del cumulo y la aparición de los cuerpos polares son los síntomas más significativos de que la maduración del ovocito sigue un curso normal.
Todos estos eventos que tienen lugar normalmente en el animal, deben llevarse a cabo a nivel de laboratorio durante el proceso de Maduración IV.
La expansión de las células del cumulo y la aparición de los cuerpos polares son los síntomas más significativos de que la maduración del ovocito sigue un curso normal.
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