La Transferencia De Embriones TE es el proceso mediante el cual los embriones son recolectados de una hembra "Donadora", antes de su implantación en el útero, para ser trasferidos al útero de otra hembra o "Receptora", de manera que complete su desarrollo gestacional y den lugar al nacimiento de una cría viable.
Rowson en la Universidad de Cambridge describió las técnicas quirúrgicas de TE en bovinos con índices de preñez excelentes, las cuales fueron una herramienta importante en su aplicación comercial en la primera mitad de los años 70s.
Los protocolos de superovulación, la elaboración y utilización del medio adecuado, la recolección y transferencia quirúrgica fueron desarrollados por BETTERIDGE, ADAMS, SEIDEL, FOOTE y ONUMA, sentando las bases para la industria de TE en la ganadería moderna, aunando los esfuerzos de la investigación y la parte comercial.
Con posterioridad además de los anteriores, HASLER, ELSDEN, ROW, DROST, MAPLETOFT, entre otros, implementaron la técnica no quirúrgica tanto para la recolección como para la trasferencia de embriones y difundieron e incrementaron las empresas comerciales de TE, propagándose como industria a nivel mundial.
Hay que considerar dos aspectos en la TE, el primero se refiere a la parte investigativa, la cual ha permitido conocer la fisiología, manejo, clasificación, preservación y manipulación de las células germinales y el embrión como tal. En este campo se pueden emplear oocitos y espermatozoides procedentes de hembras y reproductores de poco valor genético ya que su manejo y manipulación se realiza de manera experimental, células que pueden ser obtenidas de animales de granja o de matadero, como de animales de laboratorio. Además la pérdida de estas células durante los diferentes procesos no es económicamente significativa.
En la actualidad los estudios que originalmente fueron planeados para contestar preguntas básicas de fisiología, están siendo utilizados para mejorar e incrementar el empleo de la Trasferencia de Embriones en la industria bovina. Las nuevas técnicas han agregado una gran cantidad de perspectivas acerca de la utilización de la TE con fines investigativos. La producción de gemelos idénticos, clones, quimeras por mencionar algunos, seguramente contribuirán al avance de estas ciencias. Como se mencionó anteriormente, las técnicas de FIV está siendo utilizadas para el estudio de la capacidad fertilizante del semen y son de inmenso valor en el estudio de la competencia del ovocito y el metabolismo embrionerio. (MAPLETOFT).
El segundo aspecto, estrechamente relacionado con el primero pero diferente en su objetivo final, tiene que ver con su aplicación, adaptación y manejo desde el punto de vista comercial. En este aspecto las células germinales proceden de animales de alto valor genético y por consiguiente de un mayor valor económico, ya que su finalidad es la obtención de una descendencia de gran calidad genética y de producción.
Igualmente debe considerarse si la Trasferencia de Embriones se efectuará en una explotación en particular, con hembras producidas en la finca o dentro de una Central de reproducción Asistida, ya que su orientación y desarrollo tienen manejos diferentes, dado que el número de donadoras y receptoras a tratar.
La Te a nivel de finca exige condiciones óptimas de manejo acompañadas de un proceso de capacitación técnica del personal a cargo de la manipulación, alimentación, sanidad y cuidados de la ganadería en general y del programa en particular, dentro de lo que ha denominado Buenas Practicas Ganaderas BPG.
A nivel de Centrales de Reproducción Asistida, estas deben llenar los más altos estándares de Sanidad Animal, Calidad Genética y Seguridad Biológica, de tal manera que garanticen embriones de óptima calidad reflejados en crías excelentes.
APLICACIONES DE LA TE
Las principales aplicaciones de la TE son el mejoramiento genético, al incrementar la intensidad de la selección y el acortamiento del intervalo generacional. Esto ha dado lugar al proceso denominado Multiple Ovulación y Trasferencia de Embriones MOET. En muchos países se han constituido rebaños élites cuyas hembras jóvenes se emplean para conformar "MOET Juveniles", mientras que la progenie de machos está siendo seleccionada para la próxima generación de toros probados para Inseminación Artificial. Se ha estimado que de esta manera, puede duplicarse la ganancia genética en menor tiempo. (SMITH-KEPLER)
Así como la IA permitió la diseminación del potencial genético de los machos y la obtención de toros valiosos, la TE permite la difusión del material genético de hembras de alta producción, muchas de las cuales pueden ser no solamente del mismo origen, sino hermanas completas. (BETTERIDGE)
La Asociación Canadiense de Criadores de Animales desarrolló un programa para la producción y evaluación de la siguiente generación de toros donadores para IA. Las vacas donadoras seleccionadas fuero superovuladas e inseminadas con los mejores toros probados disponibles.La progenie de machos fue dejada en espera, mientras que las hembras fueron llevadas a producción. Luego los toros fueron probados a través de la historia productiva de sus hermanas, en lugar de la historia productiva de sus hijas. De esta manera se pudo evaluar genéticamente un toro en 3.5 años, mientras que el estudio de progenie tradicional tarda 5.5 años. El recorte del intervalo generacional puede dar lugar a una mayor ganancia genética en general. Además la exportación y transporte de embriones permite el traslado de progenies completas en forma de embriones congelados a menor costo. (MAPLETOFT)
TECNICA DE TRASFERENCIA DE EMBRIONES
La técnica de Trasferencia de Embriones consta en general de los siguientes pasos:
SELECCION DE LA DONADORA
La selección de las donadoras está regida por criterios de productividad, mejoramiento genético y valor agregado de las crías, ya que sus costos tienden a reducirse en la medida que aumentan estos aspectos. (MAPLETOFT)
Los principales criterios a tener en cuenta en la selección de la donadora son:
Superioridad Genética.
Debe conocerse su pedigrí, índices propios de producción y de su progenie, así como poseer las mejores características fenotípicas de la raza o tipo de ganado a producir, cuyas crías deben superiores al promedio del hato, especialmente comparadas con las hermanas de la hembra, descendientes del mismo toro. Dentro de este aspecto debe trabajarse con toros probados de alta calidad genética y mejorantes. (RUANE)
Capacidad Reproductiva
Este aspecto incluye la historia reproductiva del animal, número y facilidad de parto, habilidad materna, peso de las crías al nacimiento, destete y al año. La donadora debe encontrarse en su mejor edad reproductiva, un alto nivel de fertilidad con dos o menos servicios por concepción y un comportamiento regular en su ciclicidad durante los últimos períodos estrales.
Además es importante determinar la anatomía y funcionalidad del tracto reproductivo mediante la identificación de estructuras ováricas de buen tamaño, un cuello recto que permita el paso del catéter de forma fácil. Lo anterior se logra mediante palpación transrectal y/o ecografía, junto con la cateterización previa del tracto reproductivo. Si se selecciona hembras recién paridas, se recomienda que estén dentro del PEV establecido en el manejo reproductivo del hato, con un mínimo de 60 días postparto, para que se garantice una involución completa del útero y el reinicio de la funcionalidad ovárica (GONZALEZ)
Es conveniente saber que comportamiento tiene en su ciclicidad, si es de una, dos o tres ondas foliculares, en especial si se va a trabajar con embriones frescos o si se realizará mediante inducción y sincronización de la donadora.
Por muchos años se estableció como norma de selección de la donadora que esta debía dejar pasar dos ciclos estrales entre tratamientos SOV, con lo cual se podrían efectuar lavados a intervalos de 60 días o más. Sin embargo, HASLER y la central Genética de Holanda determinaron que es posible SOV las donadoras a intervalos de 40 días por medio de la aplicación de implantes auriculares de progesterona, luego de la administración de prostaglandinas después de la recolección de los embriones, si tener que esperar la presentación de los dos ciclos. estos cambios en los protocolos de SOV aumentaron en un 50% el número de embriones recolectados y congelados por unidad de tiempo, con fines de exportación.
Buena Condición Corporal
Como se anotó en capítulos anteriores, la CC es el reflejo de la alimentación suministrada. La donadora debe estar en un rango de CC de 3.0 a 4.0 no cebada. Las hembras donadoras deben incluirse en un programa de nutrición balanceada antes de efectuar el proceso de SOV, donde se debe procurar administrar forrajes que brinden al animal los nutrientes necesarios para que se cumplan las funciones reproductivas, además de la incorporación de productos que proporcionen al animal niveles energéticos adecuados en la dieta, así como suplementos vitamínicos y minerales (GOMEZ)
La donadora debe encontrarse en un estado sanitario óptimo, libre de enfermedades infecciosas reproductivas, por lo que antes de iniciar un programa de TE a nivel de finca, se recomienda determinar por medio de exámenes de laboratorio específicos, la incidencia de estas afecciones, cuyo costo se verá recompensados luego por un mayor porcentaje de embriones viables y el éxito del programa. Así mismo la donadora no debe haber presentado retención de placenta en su último parto o secreciones vaginales manifiestas previas al tratamiento.
Cantidad De Vacas Donadoras
La cantidad de vacas donadoras a trabajar depende de la respuesta que estas presenten a los protocolos de SOV y la cantidad de receptoras disponibles. Cuando se desea trasferir los embriones en fresco es recomendable tener por lo menos 10 receptoras por donadora con el fin de contar con el suficiente número de receptoras en celo natural, sincronizadas con el celo de la donadora y que estén en el día de desarrollo de los embriones recolectados.
El manejo de criterios estrictos de selección asegurará la superioridad genética y un alto nivel de éxito, lo que hace que el procedimiento sea más económico.
Es imposible predecir cuál será la producción de embriones de una donante primeriza en particular. Si hablamos que hay para el MOET un promedio de 5-6 embriones viables por colecta o lavado, hay que tener presente que un tercio de esas vacas no responderá al tratamiento, un tercio responderá por debajo del promedio y otro tercio lo hará por encima del promedio, siendo variable la producción de embriones entre donantes y entre colectas. una buena donadora en el primer tratamiento lo seguirá siendo en los posteriores. Esta es la gran pregunta que nos hacen los clientes y como no se deben crear falsas expectativas en un trabajo, que además genera mucha ansiedad en todos sus actores, debemos ser claros de tal manera que todos los involucrados entiendan como será en la realidad.
SELECCION DE LA RECEPTORA
La hembra receptora en los programas de TE juega un papel importante en los resultados finales, siendo una limitante en la implantación de estos programas a nivel de finca seras, ya que hay que contar con un número suficiente de hembras aptas para ser trasferidas. Por tal razón un número representativo de hatos ganaderos han redireccionado su explotación a la producción de hembras receptoras, para ser comercializadas en programas de TE.
Las receptoras deben reunir los requisitos de sanidad similares a las donadoras, así mismo tener el tamaño adecuado para permitir el desarrollo normal del feto correspondiente a la raza del embrión, contar con un canal de parto ancho y nivelado que tenga facilidades al nacimiento. Igualmente debe contar con un sistema mamarios acorde que permita una producción suficiente para sostenimiento adecuado de la cría resultante.
En el caso de de vacas receptoras, deben haber tenido 1 a 2 partos y estar dentro de un período postparto no menor de 90 días, con involución uterina completa y no estar a mamatando. (DUICA). La CC ideal es de 3 o más, que muestren buena distribución de la grasa corporal, en la práctica hembras con 360 a 460 Kls. Se recomienda que las novillas tengan una edad de 18 a 24 meses y se encuentren cerca de los 350 Kls.
Se recomienda la evaluación del desarrollo y funcionalidad del tracto reproductivo de la receptora al inicio del programa de TE, mediante palpación transrectal y examen ecográfico del mismo. Tabla 1.
Durante esta evaluación se determina la presencia de alteraciones anatómicas en especial de los cuernos y cuello. Para que los cuernos uterinos de la receptora se consideren aptos para la TE debe tener un diámetro mayor de 25 mm, con Condición del Tracto Reproductivo 3 a 5. (VELEZ)
Al igual que la donante es importante determinar la facilidad de cateterización del cuello. Así mismo tener una ciclicidad regular, con estructuras ováricas desarrolladas y funcionales. Entre mejor calidad del CL mayor índice de preñez de la receptora. Gráfico 1.
Se ha podido determinar que al evaluar las estructuras ováricas por medio de ecografía transrectal se observa que un folículo preovulatorio de 1.3 cms, da lugar a un CL de 5 mm con niveles plasmáticos de P4 de 1.22 ng/ml, midiendo a los 14 días 6 mm y niveles de P4 de 2.48 ng/ml. Para un folículo de 1.6 cms, el CL en el día 7 mide 6 mm y niveles plasmáticos de P4 de 3.05 ng/ml. Con lo anterior se espera generar unas condiciones uterinas más favorables para el desarrollo inicial del embrión y la necesidad de realizar una evaluación previa a la transferencia a la receptora, con lo cual permite obtener mejores resultados de la TE. (VASCONCELOS)
Sin embargo, la existencia de un umbral en los niveles de P4 para evitar que se presente muerte embrionaria es controversial, ya que algunos estudios reportan preñeces en receptoras con concentraciones de P4 <1 ng/ml al momento de la TE. En un estudio realizado por RODRIGUEZ et al, el promedio de los valores del diámetro del CL fué de 19.6± 1.8 con un coeficiente de varianza bajo (9%), mientras que el promedio de P4 fué de 3.6±2.6 ng/ml, con un coeficiente de varianza elevado (74%). Además, valores bajos al momento de la transferencia podría estar reflejando no solo una función lútea anormal sino también deficiencia en la detección de celos.
Diferentes trabajos han concluido que el tipo de ganado que mejor se ha comportado como receptoras son las hembras F1 resultantes del cruce de Raza Cebú con razas europeas, debido a su regularidad en el ciclo estral, facilidad y mayor intensidad del celo, docilidad de manejo y buena producción de leche para el sostenimiento de la cría.
Como mínimo se debe contar con 8 a 10 receptoras por donante cuando se hace TE en fresco. No es recomendable utilizar receptoras con más de 2 transferencias negativas (GOMEZ)
SUPEROVULACION DE LA DONADORA SOV
La superovulación SOV tiene como objetivo lograr el mayor número de oocitos a ser fecundados, para producir embriones de alta calidad que puedan ser transferibles y progresen a un proceso gestacional que finalmente de lugar al nacimiento de una cría normal viable. La gran variabilidad en la respuesta a los tratamientos SOV, el tiempo requerido y los esfuerzos necesarios para la administración de las hormonas empleadas en ellos, así como la predicción incierta de los resultados, ha hecho que se afecte la difusión de la TE.
De otra parte, los avances logrados en los últimos años no han podido aumentar de manera significativa el número de embriones transferibles por tratamiento SOV. La implementación de protocolos que controlan la emergencia de la onda folicular y la ovulación aplicados en la IATF, han facilitado la SOV de grupos de donantes, independientemente del período del ciclo estral en que se encuentren y la IA, sin la necesidad de detectar celos. Sin embargo aún se presentan inconvenientes que potencialmente pueden dar lugar a errores y afectar la respuesta superovulatoria o aún peor una ausencia total de respuesta.
De otra parte, el número de embriones transferibles en vacas reproductivamente normales se ha mantenido relativamente constante, tanto en vacas de leche como de carne. LOONEY reportó un promedio de 11.5 embriones recolectados, con un promedio de 6.2 transferibles en más de 2000 vacas de 14 razas. El 24% de las recolecciones no produjo embriones viables, 64% de las donadoras produjo menos del número de embriones transferibles y el 30% de las recolecciones produjo el 70% de los embriones.
Otro estudio retrospectivo que incluyó 1263 donantes encontró que solamente el 68% de las hembras inducidas a superovular produjeron embriones transferibles. El 32% restante lo integraron: 7% sin estimulación ovárica, 7% sin recolección de de oocitos ni embriones, 17% sin embriones transferibles, 1% donde no se efectuó el lavado porque presentaron celo antes de la administración de PGF2α durante el tratamiento hormonal (BELACUBA)
Estos promedios pueden compararse con los datos aportados por la AETA en los cuales el promedio fue de 7.0 en ganado de carne con más de 24.000 donadoras y 6.3 en vacas de leche con más de 15.000 donadoras en 2011. (MAPLETOFT).
Igualmente, al evaluar el promedio de embriones recolectados por 4 empresas comerciales, este no ha variado en los últimos 20 años, lo que confirma los datos de la AETA. (HASLER)
En la Tabla 4 se presentan los principales factores que influyen en la respuesta SOV, ya sea con relación al tratamiento como a la donante. Todos estos factores deben tenerse en cuenta al momento de seleccionar el protocolo a implementar, por lo que tiene gran relevancia el criterio y la experiencia del profesional que lo realiza.
Tipo de Gonadotropina.
En comienzo en el proceso SOV se utilizaron productos cuyo principio activo era la Gonadotropina Sérica de Yegua Preñada PMSG, elaborada por medio de la recolección de sangre de yeguas con 80 - 120 días, en la actualidad denominada Gonadotropina Corionica equina eCG. Estos preparados produjeron una gran variabilidad de respuesta SOV y sus índices de recuperación estuvieron influenciadas negativamente por una excesiva reacción ovulatoria y una menor sensibilidad de respuesta a tratamientos repetidos.
Esta reacción se debe a un período de persistencia de más de 10 días en la circulación general, produciéndose una estimulación ovárica continua, folículos anovulatorios, perfiles endocrinos anormales y embriones de baja calidad. (MOOR)
FOLIGON ® . Dosis 1500 a 3000 UI IM. entre los días 8 a 13 del ciclo, seguidos de 3 ml de Prosolvin ® 48 horas después. (INTERVET)
Con posterioridad se pudo disponer de productos a base de extractos pituitarios de mayor actividad FSH que LH, puesto que no se pueden obtener puros de una u otra hormona, al administrarse en inyecciones múltiples y al comparlos con la administración de una dosis única de eCG, se logró obtener un mayor número de embriones buenos. Los extractos piutuitarios se FSH/LH con ajo contenido LH han mejorado la respuesta SOV en el ganado. (HASLER)
Pureza
Aunque en general se considera que es necesaria la presencia de cierta cantidad de LH en estos preparados para el éxito de la SOV, la relación FSH/LH debe ser adecuada para que favorezcan el desarrollo final de los folículos. Se ha sostenido que una dosis elevada de extractos pituitarios cuya relación FSH/LH contengan mayor cantidad de LH, induce una activación prematura del oocito lo que se refleja en una reducción significativa del porcentaje de oocitos fertilizados y embriones transferibles. (GONZALEZ)
Puesto que el período de vida biológica de la FSH es de 5 horas o menos, esta debe administrarse dos veces al día para la inducción de la SOV. (LOONELY)
Sin embargo estudios recientes han reportado que la producción de fármacos a base de FSH, mediante técnica recombinante, inducen una respuesta SOV sin adición de LH exogena y que la calidad de los embriones puede ser superior. (LOONELY)
Además de estos estudios y otros más recientes que emplearon FSH recombinante indican que en el futuro se utilizarán gonadotropinas recombinantes, en la actualidad no se emplean por sus altos costos (ROGAN)
Momento del inicio de la SOV
Los tratamientos de SOV generalmente se inician entre los días 8 y 12 del ciclo estral (celo = Día 0), sin embargo se ha demostrado una mayor respuesta SOV cuando los tratamientos se inician el día 9 del ciclo. Esta observación ha sido sustentada recientemente mediante ecografía al apreciarse que la segunda onda folicular empieza 8.5 días después de la ovulación (día 9.5 del ciclo) en las vacas de tres ondas foliculares y en el día 9.5 post ovulación (10.5 días del ciclo) en vacas de dos ondas foliculares. (GINTHER)
En un sentido práctico, es lógico suponer que las vacas con dos ondas foliculares tienden a tener ciclos más cortos (18-20 días) que las vacas de tres ondas (21-23 días). Por esta razón, la duración del ciclo estral anterior de la donadora puede proporcionar una pista sobre cual puede ser el mejor día para iniciar el tratamiento SOV. (MAPLETOFT)
Moor y col, sugirieron que tanto la tasa de ovulación como el número de embriones viables producidos son relativamente consistentes dentro de los mismos individuos; los animales que responden poco en un ensayo lo seguían haciendo en tratamientos subsiguientes, mientras que aquellos animales que respondieron bien inicialmente, lo continúan haciendo de ese modo. Aunque hubo una gran variabilidad entre vacas, se ha visto que el número de folículos >1.7 mm de diámetro en un ovario, se correlaciono positivamente con la respuesta SOV a los tratamientos con gonadotropinas. Mas recientemente SINGH y col, demostraron que el número de folículos presentes en el momento de la emergencia de la onda folicular permite predecir la respuesta SOV.
Estado de desarrollo folicular al inicio del tratamiento SOV
Otro factor relacionado con la donante en si misma, se refiere al estado de desarrollo folicular al momento de iniciar el tratamiento. Esto tiene mayor importancia cuando en el proceso de TE se utiliza la detección del celo de la donante para iniciar el tratamiento.
La ecografía de los ovarios puede proveer información acerca del momento más apropiado para iniciar los tratamientos SOV, con el fin de obtener la máxima respuesta de una vaca en particular. Durante la mitad del desarrollo de una onda folicular, el folículo dominante FD, actuando local o sistemicamente, induce la atresia de otros folículos en desarrollo. En este sentido se ha demostrado que el inicio de los tratamientos SOV en presencia de un FD resulta en un 40-50% de disminución en la respuesta SOV. (SHAW)
Igualmente se ha determinado que existe una alta correlación entre el número de folículos pequeños al momento de iniciar el tratamiento y la respuesta SOV. En conjunto, estos datos sugieren que se puede esperar una disminución en la respuesta SOV si está presente un FD activo al momento de iniciar los tratamientos y que la presencia de folículos que están creciendo activamente en un rango de 3-6 mm de diámetro (emergencia de la onda folicular) puede estar asociada con una mejor respuesta SOV. A través de solo un examen ecográfico en condiciones de campo es difícil determinar si un folículo grande es o no funcionalmente dominante y si los folículos pequeños están creciendo activamente o están sufriendo atresia. Sin embargo, la presencia de más de seis o siete folículos de 3-6 mm de diámetro 8 a 10 días después de la ovulación, en presencia de un folículo grande, provee suficiente evidencia del inicio de una nueva onda de desarrollo folicular. (SINGH)
Raza
La raza es un factor presente en los tratamientos SOV ya que en varios estudios se ha determinado que las vacas Holstein requieren de una mayor proporción de FSH,mientras las vacas Charolaise requieren una mayor proporción de LH para una máxima respuesta SOV.
Dosis SOV y via de adminsitración
Los resultados de diferentes trabajos indican que la dosis ideal para vacas Bos Taurus es de 400 mg de Folltropin ®, para vacas Bos Indicus es de 260 a 320 mg y para novillas 200 a 260 mg, con resultados altamente satisfactorios. El ganado Bos Indicus responde exageradamente a dosis altas de FSH, encontrandose respuestas satisfactorias con dosis de 133 a 200 mg de Folltropin-V® y de 200 a 260 mg en sus cruces (BELACUBA)
En cuanto a las dosis empleadas algunos prefieren dosis uniformes y otros prefieren dosis descendentes de FSH, siendo la mejor vía de administración la IM, al compararla con la vía SC.
Momento de la IA y Calidad seminal.
Otro factor no menos importante se refiere a la calidad del semen, el momento de la IA y la habilidad del inseminador. Existen evidencias de la existencia de una relación positiva entre la calidad del semen, el índice de fertilidad y la calidad embrionaria, por parte de Centros Comerciales de Reproducción Asistida en programas de TE.
Condición Corporal CC
En términos generales se considera que la CC influye en la respuesta SOV, de manera similar a lo que se presenta en las hembras no tratadas, por lo que se asume que el nivel de energía de la ración influye en las tasas de ovulación y fecundación como en la viabilidad de los embriones. Hanselmann demostró que las donadoras a nivel de campo tuvieron 2.2 embriones transferibles más que las estabuladas.
Intervalo Entre Recolecciones
Durante muchos años se ha tenido como norma que se debe dejar que pasen dos ciclos de la donadora antes de iniciar un nuevo tratamiento de SOV. Así mismo es práctica común administrar PGF2α después de la recolección, a las donadoras que no retornaron en celo dentro de las 3 semanas siguientes. En consecuencia este protocolo permite que se pueda efectuar recolecciones a intervalos de 60 días o más. Sin embargo HASLER realizó SOVs a intervalos de 40 días sin necesidad de tener que esperar a que se presentaran ciclos estrales entre lavados. Este cambio de protocolo,. incrementó en un 50% el número de embriones recolectados y congelados por unidad de tiempo en Holland Genetics. MAPLETOFT ha realizado lavados a intervalos de 30 días, método que se presenta más adelante. Hoy en día muchos profesionales en TE han adoptado estos protocolos para efectuar SOVs a intervalos de 40 y 30 días.
PROTOCOLOS DE SUPEROVULACION SOV
En los años 70s se utilizó la eCG como hormona superovulatoria, empleando el protocolo descrito en el Grafico 2. Se inicia en el día de presentación del celo detectado, Día 0. La dosis de eCG es una sola administrada en el día 10, seguida de PGF2α el día 12 a IA los días 14 y 15, efectuando el lavado, recolección y transferencia en fresco el día 22.
Sin embargo por su gran variabilidad de respuesta y ante la implementación de protocolos a base de FSH se restringió su aplicación.
Con posterioridad se ha utilizado el protocolo tradicional de SOV Gráfico 3, el cual se inicia teniendo como base la detección del celo o Día 0, aplicando la FSH (FOLLTROPIN-V® - PLUSET®), a partir del día 10, seguida de la administración de PGF2α a las 48 horas, por lo que normalmente se presenta celo a las 36 a 48 horas, efectuando las inseminaciones, con o sin manifestaciones de celo a las 60 y 72 horas, luego de la PGF2α. Las vacas que presentan celo antes de lo esperado, no más de 24 horas, se les puede suspender la administración de FSH y se inseminan a las 12 y 24 horas de iniciado el celo. Las vacas que entran en celo un día después de lo esperado se insemina pero van a tener un respuesta baja (1 a 2 CLs) (BELACUBA)
Hay divergencias en cuanto al número de inseminaciones, unos realizan 2 inseminaciones a las 12 y 24 horas de iniciado el celo y otros 3 inseminaciones a las 0 - 12 y 24 horas de iniciado el celo. Sin embargo, no hay un protocolo con una sola inseminación que haya sido eceptado como superior (STROUD)
Las receptoras son tratadas con PGF2α 18 a 24 horas antes de la primera inseminación de la donante, de manera que presente celo en sincronía con la donante. Hay profesionales que prefieren detectar celo en el lote de receptoras y utilizar aquellas que presentaron celo un día antes o un día después de la donante (BO)
El inicio del tratamiennto SOV en los protocolos convencionales se basa en que la mayoría de las vacas se encuentran en el comienzo de la segunda onda folicular en el día 10, habiéndose demostrado que la respuesta SOV es mayor cuando el tratamiento con FSH se inicia en el momento exacto de la emergencia folicular, en lugar de 1 o 2 días después. Teniendo en cuenta lo
anterior, los tratamientos convencionales para ser aplicados a un grupo de donantes, presentan varios inconvenientes:
Rowson en la Universidad de Cambridge describió las técnicas quirúrgicas de TE en bovinos con índices de preñez excelentes, las cuales fueron una herramienta importante en su aplicación comercial en la primera mitad de los años 70s.
Los protocolos de superovulación, la elaboración y utilización del medio adecuado, la recolección y transferencia quirúrgica fueron desarrollados por BETTERIDGE, ADAMS, SEIDEL, FOOTE y ONUMA, sentando las bases para la industria de TE en la ganadería moderna, aunando los esfuerzos de la investigación y la parte comercial.
Con posterioridad además de los anteriores, HASLER, ELSDEN, ROW, DROST, MAPLETOFT, entre otros, implementaron la técnica no quirúrgica tanto para la recolección como para la trasferencia de embriones y difundieron e incrementaron las empresas comerciales de TE, propagándose como industria a nivel mundial.
Hay que considerar dos aspectos en la TE, el primero se refiere a la parte investigativa, la cual ha permitido conocer la fisiología, manejo, clasificación, preservación y manipulación de las células germinales y el embrión como tal. En este campo se pueden emplear oocitos y espermatozoides procedentes de hembras y reproductores de poco valor genético ya que su manejo y manipulación se realiza de manera experimental, células que pueden ser obtenidas de animales de granja o de matadero, como de animales de laboratorio. Además la pérdida de estas células durante los diferentes procesos no es económicamente significativa.
En la actualidad los estudios que originalmente fueron planeados para contestar preguntas básicas de fisiología, están siendo utilizados para mejorar e incrementar el empleo de la Trasferencia de Embriones en la industria bovina. Las nuevas técnicas han agregado una gran cantidad de perspectivas acerca de la utilización de la TE con fines investigativos. La producción de gemelos idénticos, clones, quimeras por mencionar algunos, seguramente contribuirán al avance de estas ciencias. Como se mencionó anteriormente, las técnicas de FIV está siendo utilizadas para el estudio de la capacidad fertilizante del semen y son de inmenso valor en el estudio de la competencia del ovocito y el metabolismo embrionerio. (MAPLETOFT).
El segundo aspecto, estrechamente relacionado con el primero pero diferente en su objetivo final, tiene que ver con su aplicación, adaptación y manejo desde el punto de vista comercial. En este aspecto las células germinales proceden de animales de alto valor genético y por consiguiente de un mayor valor económico, ya que su finalidad es la obtención de una descendencia de gran calidad genética y de producción.
Igualmente debe considerarse si la Trasferencia de Embriones se efectuará en una explotación en particular, con hembras producidas en la finca o dentro de una Central de reproducción Asistida, ya que su orientación y desarrollo tienen manejos diferentes, dado que el número de donadoras y receptoras a tratar.
La Te a nivel de finca exige condiciones óptimas de manejo acompañadas de un proceso de capacitación técnica del personal a cargo de la manipulación, alimentación, sanidad y cuidados de la ganadería en general y del programa en particular, dentro de lo que ha denominado Buenas Practicas Ganaderas BPG.
A nivel de Centrales de Reproducción Asistida, estas deben llenar los más altos estándares de Sanidad Animal, Calidad Genética y Seguridad Biológica, de tal manera que garanticen embriones de óptima calidad reflejados en crías excelentes.
APLICACIONES DE LA TE
Las principales aplicaciones de la TE son el mejoramiento genético, al incrementar la intensidad de la selección y el acortamiento del intervalo generacional. Esto ha dado lugar al proceso denominado Multiple Ovulación y Trasferencia de Embriones MOET. En muchos países se han constituido rebaños élites cuyas hembras jóvenes se emplean para conformar "MOET Juveniles", mientras que la progenie de machos está siendo seleccionada para la próxima generación de toros probados para Inseminación Artificial. Se ha estimado que de esta manera, puede duplicarse la ganancia genética en menor tiempo. (SMITH-KEPLER)
Así como la IA permitió la diseminación del potencial genético de los machos y la obtención de toros valiosos, la TE permite la difusión del material genético de hembras de alta producción, muchas de las cuales pueden ser no solamente del mismo origen, sino hermanas completas. (BETTERIDGE)
La Asociación Canadiense de Criadores de Animales desarrolló un programa para la producción y evaluación de la siguiente generación de toros donadores para IA. Las vacas donadoras seleccionadas fuero superovuladas e inseminadas con los mejores toros probados disponibles.La progenie de machos fue dejada en espera, mientras que las hembras fueron llevadas a producción. Luego los toros fueron probados a través de la historia productiva de sus hermanas, en lugar de la historia productiva de sus hijas. De esta manera se pudo evaluar genéticamente un toro en 3.5 años, mientras que el estudio de progenie tradicional tarda 5.5 años. El recorte del intervalo generacional puede dar lugar a una mayor ganancia genética en general. Además la exportación y transporte de embriones permite el traslado de progenies completas en forma de embriones congelados a menor costo. (MAPLETOFT)
La técnica de Trasferencia de Embriones consta en general de los siguientes pasos:
- Selección de la Donadora.
- Selección de la Receptora.
- Superovulación de la Donadora.
- Fertilización de la Donadora.
- Recolección de Embriones.
- Evaluación y Clasificación de Embriones.
- Trasferencia de los Embriones
- Criopreservación de los Embriones.
SELECCION DE LA DONADORA
La selección de las donadoras está regida por criterios de productividad, mejoramiento genético y valor agregado de las crías, ya que sus costos tienden a reducirse en la medida que aumentan estos aspectos. (MAPLETOFT)
Los principales criterios a tener en cuenta en la selección de la donadora son:
Superioridad Genética.
Debe conocerse su pedigrí, índices propios de producción y de su progenie, así como poseer las mejores características fenotípicas de la raza o tipo de ganado a producir, cuyas crías deben superiores al promedio del hato, especialmente comparadas con las hermanas de la hembra, descendientes del mismo toro. Dentro de este aspecto debe trabajarse con toros probados de alta calidad genética y mejorantes. (RUANE)
Capacidad Reproductiva
Este aspecto incluye la historia reproductiva del animal, número y facilidad de parto, habilidad materna, peso de las crías al nacimiento, destete y al año. La donadora debe encontrarse en su mejor edad reproductiva, un alto nivel de fertilidad con dos o menos servicios por concepción y un comportamiento regular en su ciclicidad durante los últimos períodos estrales.
Además es importante determinar la anatomía y funcionalidad del tracto reproductivo mediante la identificación de estructuras ováricas de buen tamaño, un cuello recto que permita el paso del catéter de forma fácil. Lo anterior se logra mediante palpación transrectal y/o ecografía, junto con la cateterización previa del tracto reproductivo. Si se selecciona hembras recién paridas, se recomienda que estén dentro del PEV establecido en el manejo reproductivo del hato, con un mínimo de 60 días postparto, para que se garantice una involución completa del útero y el reinicio de la funcionalidad ovárica (GONZALEZ)
Es conveniente saber que comportamiento tiene en su ciclicidad, si es de una, dos o tres ondas foliculares, en especial si se va a trabajar con embriones frescos o si se realizará mediante inducción y sincronización de la donadora.
Por muchos años se estableció como norma de selección de la donadora que esta debía dejar pasar dos ciclos estrales entre tratamientos SOV, con lo cual se podrían efectuar lavados a intervalos de 60 días o más. Sin embargo, HASLER y la central Genética de Holanda determinaron que es posible SOV las donadoras a intervalos de 40 días por medio de la aplicación de implantes auriculares de progesterona, luego de la administración de prostaglandinas después de la recolección de los embriones, si tener que esperar la presentación de los dos ciclos. estos cambios en los protocolos de SOV aumentaron en un 50% el número de embriones recolectados y congelados por unidad de tiempo, con fines de exportación.
Buena Condición Corporal
Como se anotó en capítulos anteriores, la CC es el reflejo de la alimentación suministrada. La donadora debe estar en un rango de CC de 3.0 a 4.0 no cebada. Las hembras donadoras deben incluirse en un programa de nutrición balanceada antes de efectuar el proceso de SOV, donde se debe procurar administrar forrajes que brinden al animal los nutrientes necesarios para que se cumplan las funciones reproductivas, además de la incorporación de productos que proporcionen al animal niveles energéticos adecuados en la dieta, así como suplementos vitamínicos y minerales (GOMEZ)
La donadora debe encontrarse en un estado sanitario óptimo, libre de enfermedades infecciosas reproductivas, por lo que antes de iniciar un programa de TE a nivel de finca, se recomienda determinar por medio de exámenes de laboratorio específicos, la incidencia de estas afecciones, cuyo costo se verá recompensados luego por un mayor porcentaje de embriones viables y el éxito del programa. Así mismo la donadora no debe haber presentado retención de placenta en su último parto o secreciones vaginales manifiestas previas al tratamiento.
Cantidad De Vacas Donadoras
La cantidad de vacas donadoras a trabajar depende de la respuesta que estas presenten a los protocolos de SOV y la cantidad de receptoras disponibles. Cuando se desea trasferir los embriones en fresco es recomendable tener por lo menos 10 receptoras por donadora con el fin de contar con el suficiente número de receptoras en celo natural, sincronizadas con el celo de la donadora y que estén en el día de desarrollo de los embriones recolectados.
El manejo de criterios estrictos de selección asegurará la superioridad genética y un alto nivel de éxito, lo que hace que el procedimiento sea más económico.
Es imposible predecir cuál será la producción de embriones de una donante primeriza en particular. Si hablamos que hay para el MOET un promedio de 5-6 embriones viables por colecta o lavado, hay que tener presente que un tercio de esas vacas no responderá al tratamiento, un tercio responderá por debajo del promedio y otro tercio lo hará por encima del promedio, siendo variable la producción de embriones entre donantes y entre colectas. una buena donadora en el primer tratamiento lo seguirá siendo en los posteriores. Esta es la gran pregunta que nos hacen los clientes y como no se deben crear falsas expectativas en un trabajo, que además genera mucha ansiedad en todos sus actores, debemos ser claros de tal manera que todos los involucrados entiendan como será en la realidad.
SELECCION DE LA RECEPTORA
La hembra receptora en los programas de TE juega un papel importante en los resultados finales, siendo una limitante en la implantación de estos programas a nivel de finca seras, ya que hay que contar con un número suficiente de hembras aptas para ser trasferidas. Por tal razón un número representativo de hatos ganaderos han redireccionado su explotación a la producción de hembras receptoras, para ser comercializadas en programas de TE.
Las receptoras deben reunir los requisitos de sanidad similares a las donadoras, así mismo tener el tamaño adecuado para permitir el desarrollo normal del feto correspondiente a la raza del embrión, contar con un canal de parto ancho y nivelado que tenga facilidades al nacimiento. Igualmente debe contar con un sistema mamarios acorde que permita una producción suficiente para sostenimiento adecuado de la cría resultante.
En el caso de de vacas receptoras, deben haber tenido 1 a 2 partos y estar dentro de un período postparto no menor de 90 días, con involución uterina completa y no estar a mamatando. (DUICA). La CC ideal es de 3 o más, que muestren buena distribución de la grasa corporal, en la práctica hembras con 360 a 460 Kls. Se recomienda que las novillas tengan una edad de 18 a 24 meses y se encuentren cerca de los 350 Kls.
Durante esta evaluación se determina la presencia de alteraciones anatómicas en especial de los cuernos y cuello. Para que los cuernos uterinos de la receptora se consideren aptos para la TE debe tener un diámetro mayor de 25 mm, con Condición del Tracto Reproductivo 3 a 5. (VELEZ)
Se ha podido determinar que al evaluar las estructuras ováricas por medio de ecografía transrectal se observa que un folículo preovulatorio de 1.3 cms, da lugar a un CL de 5 mm con niveles plasmáticos de P4 de 1.22 ng/ml, midiendo a los 14 días 6 mm y niveles de P4 de 2.48 ng/ml. Para un folículo de 1.6 cms, el CL en el día 7 mide 6 mm y niveles plasmáticos de P4 de 3.05 ng/ml. Con lo anterior se espera generar unas condiciones uterinas más favorables para el desarrollo inicial del embrión y la necesidad de realizar una evaluación previa a la transferencia a la receptora, con lo cual permite obtener mejores resultados de la TE. (VASCONCELOS)
Sin embargo, la existencia de un umbral en los niveles de P4 para evitar que se presente muerte embrionaria es controversial, ya que algunos estudios reportan preñeces en receptoras con concentraciones de P4 <1 ng/ml al momento de la TE. En un estudio realizado por RODRIGUEZ et al, el promedio de los valores del diámetro del CL fué de 19.6± 1.8 con un coeficiente de varianza bajo (9%), mientras que el promedio de P4 fué de 3.6±2.6 ng/ml, con un coeficiente de varianza elevado (74%). Además, valores bajos al momento de la transferencia podría estar reflejando no solo una función lútea anormal sino también deficiencia en la detección de celos.
Como mínimo se debe contar con 8 a 10 receptoras por donante cuando se hace TE en fresco. No es recomendable utilizar receptoras con más de 2 transferencias negativas (GOMEZ)
SUPEROVULACION DE LA DONADORA SOV
La superovulación SOV tiene como objetivo lograr el mayor número de oocitos a ser fecundados, para producir embriones de alta calidad que puedan ser transferibles y progresen a un proceso gestacional que finalmente de lugar al nacimiento de una cría normal viable. La gran variabilidad en la respuesta a los tratamientos SOV, el tiempo requerido y los esfuerzos necesarios para la administración de las hormonas empleadas en ellos, así como la predicción incierta de los resultados, ha hecho que se afecte la difusión de la TE.
De otra parte, los avances logrados en los últimos años no han podido aumentar de manera significativa el número de embriones transferibles por tratamiento SOV. La implementación de protocolos que controlan la emergencia de la onda folicular y la ovulación aplicados en la IATF, han facilitado la SOV de grupos de donantes, independientemente del período del ciclo estral en que se encuentren y la IA, sin la necesidad de detectar celos. Sin embargo aún se presentan inconvenientes que potencialmente pueden dar lugar a errores y afectar la respuesta superovulatoria o aún peor una ausencia total de respuesta.
De otra parte, el número de embriones transferibles en vacas reproductivamente normales se ha mantenido relativamente constante, tanto en vacas de leche como de carne. LOONEY reportó un promedio de 11.5 embriones recolectados, con un promedio de 6.2 transferibles en más de 2000 vacas de 14 razas. El 24% de las recolecciones no produjo embriones viables, 64% de las donadoras produjo menos del número de embriones transferibles y el 30% de las recolecciones produjo el 70% de los embriones.Otro estudio retrospectivo que incluyó 1263 donantes encontró que solamente el 68% de las hembras inducidas a superovular produjeron embriones transferibles. El 32% restante lo integraron: 7% sin estimulación ovárica, 7% sin recolección de de oocitos ni embriones, 17% sin embriones transferibles, 1% donde no se efectuó el lavado porque presentaron celo antes de la administración de PGF2α durante el tratamiento hormonal (BELACUBA)
Estos promedios pueden compararse con los datos aportados por la AETA en los cuales el promedio fue de 7.0 en ganado de carne con más de 24.000 donadoras y 6.3 en vacas de leche con más de 15.000 donadoras en 2011. (MAPLETOFT).
Igualmente, al evaluar el promedio de embriones recolectados por 4 empresas comerciales, este no ha variado en los últimos 20 años, lo que confirma los datos de la AETA. (HASLER)
En la Tabla 4 se presentan los principales factores que influyen en la respuesta SOV, ya sea con relación al tratamiento como a la donante. Todos estos factores deben tenerse en cuenta al momento de seleccionar el protocolo a implementar, por lo que tiene gran relevancia el criterio y la experiencia del profesional que lo realiza.
Tipo de Gonadotropina.
En comienzo en el proceso SOV se utilizaron productos cuyo principio activo era la Gonadotropina Sérica de Yegua Preñada PMSG, elaborada por medio de la recolección de sangre de yeguas con 80 - 120 días, en la actualidad denominada Gonadotropina Corionica equina eCG. Estos preparados produjeron una gran variabilidad de respuesta SOV y sus índices de recuperación estuvieron influenciadas negativamente por una excesiva reacción ovulatoria y una menor sensibilidad de respuesta a tratamientos repetidos.
Esta reacción se debe a un período de persistencia de más de 10 días en la circulación general, produciéndose una estimulación ovárica continua, folículos anovulatorios, perfiles endocrinos anormales y embriones de baja calidad. (MOOR)
FOLIGON ® . Dosis 1500 a 3000 UI IM. entre los días 8 a 13 del ciclo, seguidos de 3 ml de Prosolvin ® 48 horas después. (INTERVET)
Pureza
Aunque en general se considera que es necesaria la presencia de cierta cantidad de LH en estos preparados para el éxito de la SOV, la relación FSH/LH debe ser adecuada para que favorezcan el desarrollo final de los folículos. Se ha sostenido que una dosis elevada de extractos pituitarios cuya relación FSH/LH contengan mayor cantidad de LH, induce una activación prematura del oocito lo que se refleja en una reducción significativa del porcentaje de oocitos fertilizados y embriones transferibles. (GONZALEZ)
Puesto que el período de vida biológica de la FSH es de 5 horas o menos, esta debe administrarse dos veces al día para la inducción de la SOV. (LOONELY)
Sin embargo estudios recientes han reportado que la producción de fármacos a base de FSH, mediante técnica recombinante, inducen una respuesta SOV sin adición de LH exogena y que la calidad de los embriones puede ser superior. (LOONELY)
Además de estos estudios y otros más recientes que emplearon FSH recombinante indican que en el futuro se utilizarán gonadotropinas recombinantes, en la actualidad no se emplean por sus altos costos (ROGAN)
Momento del inicio de la SOV
En un sentido práctico, es lógico suponer que las vacas con dos ondas foliculares tienden a tener ciclos más cortos (18-20 días) que las vacas de tres ondas (21-23 días). Por esta razón, la duración del ciclo estral anterior de la donadora puede proporcionar una pista sobre cual puede ser el mejor día para iniciar el tratamiento SOV. (MAPLETOFT)
Moor y col, sugirieron que tanto la tasa de ovulación como el número de embriones viables producidos son relativamente consistentes dentro de los mismos individuos; los animales que responden poco en un ensayo lo seguían haciendo en tratamientos subsiguientes, mientras que aquellos animales que respondieron bien inicialmente, lo continúan haciendo de ese modo. Aunque hubo una gran variabilidad entre vacas, se ha visto que el número de folículos >1.7 mm de diámetro en un ovario, se correlaciono positivamente con la respuesta SOV a los tratamientos con gonadotropinas. Mas recientemente SINGH y col, demostraron que el número de folículos presentes en el momento de la emergencia de la onda folicular permite predecir la respuesta SOV.
Estado de desarrollo folicular al inicio del tratamiento SOV
Otro factor relacionado con la donante en si misma, se refiere al estado de desarrollo folicular al momento de iniciar el tratamiento. Esto tiene mayor importancia cuando en el proceso de TE se utiliza la detección del celo de la donante para iniciar el tratamiento.
La ecografía de los ovarios puede proveer información acerca del momento más apropiado para iniciar los tratamientos SOV, con el fin de obtener la máxima respuesta de una vaca en particular. Durante la mitad del desarrollo de una onda folicular, el folículo dominante FD, actuando local o sistemicamente, induce la atresia de otros folículos en desarrollo. En este sentido se ha demostrado que el inicio de los tratamientos SOV en presencia de un FD resulta en un 40-50% de disminución en la respuesta SOV. (SHAW)
Igualmente se ha determinado que existe una alta correlación entre el número de folículos pequeños al momento de iniciar el tratamiento y la respuesta SOV. En conjunto, estos datos sugieren que se puede esperar una disminución en la respuesta SOV si está presente un FD activo al momento de iniciar los tratamientos y que la presencia de folículos que están creciendo activamente en un rango de 3-6 mm de diámetro (emergencia de la onda folicular) puede estar asociada con una mejor respuesta SOV. A través de solo un examen ecográfico en condiciones de campo es difícil determinar si un folículo grande es o no funcionalmente dominante y si los folículos pequeños están creciendo activamente o están sufriendo atresia. Sin embargo, la presencia de más de seis o siete folículos de 3-6 mm de diámetro 8 a 10 días después de la ovulación, en presencia de un folículo grande, provee suficiente evidencia del inicio de una nueva onda de desarrollo folicular. (SINGH)
Raza
La raza es un factor presente en los tratamientos SOV ya que en varios estudios se ha determinado que las vacas Holstein requieren de una mayor proporción de FSH,mientras las vacas Charolaise requieren una mayor proporción de LH para una máxima respuesta SOV.
Dosis SOV y via de adminsitración
En cuanto a las dosis empleadas algunos prefieren dosis uniformes y otros prefieren dosis descendentes de FSH, siendo la mejor vía de administración la IM, al compararla con la vía SC.
Momento de la IA y Calidad seminal.
Otro factor no menos importante se refiere a la calidad del semen, el momento de la IA y la habilidad del inseminador. Existen evidencias de la existencia de una relación positiva entre la calidad del semen, el índice de fertilidad y la calidad embrionaria, por parte de Centros Comerciales de Reproducción Asistida en programas de TE.
Condición Corporal CC
En términos generales se considera que la CC influye en la respuesta SOV, de manera similar a lo que se presenta en las hembras no tratadas, por lo que se asume que el nivel de energía de la ración influye en las tasas de ovulación y fecundación como en la viabilidad de los embriones. Hanselmann demostró que las donadoras a nivel de campo tuvieron 2.2 embriones transferibles más que las estabuladas.
Intervalo Entre Recolecciones
PROTOCOLOS DE SUPEROVULACION SOV
Sin embargo por su gran variabilidad de respuesta y ante la implementación de protocolos a base de FSH se restringió su aplicación.
Hay divergencias en cuanto al número de inseminaciones, unos realizan 2 inseminaciones a las 12 y 24 horas de iniciado el celo y otros 3 inseminaciones a las 0 - 12 y 24 horas de iniciado el celo. Sin embargo, no hay un protocolo con una sola inseminación que haya sido eceptado como superior (STROUD)
Las receptoras son tratadas con PGF2α 18 a 24 horas antes de la primera inseminación de la donante, de manera que presente celo en sincronía con la donante. Hay profesionales que prefieren detectar celo en el lote de receptoras y utilizar aquellas que presentaron celo un día antes o un día después de la donante (BO)
El inicio del tratamiennto SOV en los protocolos convencionales se basa en que la mayoría de las vacas se encuentran en el comienzo de la segunda onda folicular en el día 10, habiéndose demostrado que la respuesta SOV es mayor cuando el tratamiento con FSH se inicia en el momento exacto de la emergencia folicular, en lugar de 1 o 2 días después. Teniendo en cuenta lo
anterior, los tratamientos convencionales para ser aplicados a un grupo de donantes, presentan varios inconvenientes:
1.- Se requiere de un sistema de detección de celos eficaz, con dedicación casi exclusiva del personal encargado y una respuesta del 100% efectiva a la presincronización de las donantes, para determinar el denominado "Celo Base".
2.- Desde el punto de vista práctico, es imposible tener a todas las donantes iniciando una onda folicular al mismo tiempo y por consiguiente en el mismo día elegido para la administración de la FSH
3.- El número necesario de receptoras sería demasiado grande y dependería del número de donabtes, haciendo aún menos práctico el tratar grupos numerosos de donantes, en especial si la TE se efectúa con embriones en fresco.
Los avances obtenidos sobre la dinámica folicular y el manejo del ciclo estral, no han permitido lograr un mejoramiento en el número de embriones transferibles con el tratamiento SOV. Sin embargo, el desarrollo de protocolos que facilitan el control de la emergencia folicular y la ovulación han facilitado la SOV e IATF de las donadoras, sin necesidad de detectar celos. Lo anterior constituye una avance importante en la aplicación comercial de la TE por parte de las Centrales de Reproducción Asistida, quienes pueden efectuar tratamientos SOV, IATF, TE y TETF de forma masiva. Por otra parte se siguen presentando algunos inconvenientes que dan lugar a una disminución en la respuesta a la SOV, o peor aún, una ausencia total de respuesta, los cuales deben ser abocados y solucionados por el profesional.
Con el fin de darle un mejor manejo y tratar un mayor número de donadoras, se adaptaron los protocolos empleados en IATF para la sincronización de las ondas folicular y la ovulación, utilizando GnRH o Estradioles, junto con progestágenos en implantes auriculares o DIV, además de PGF2α. Lo anterior ha dado lugar a nuevos protocolos de TE.
El inconveniente de este método es que hay que dominar la técnica de aspiración OPU por parte del profesional, lo que hace que se adapte más a Centros de Reproducción, donde todas las se encuentran concentradas en un solo lugar, al contrario de la SOV en donadoras a nivel de finca.
Otros trabajos aspiraron los dos folículos más grandes, sin embargo la diferencia en la respuesta SOV no ha sido lo suficientemente significativa en relación con los protocolos SOV convencionales. (BELACUBA)
La posibilidad de elegir la inducción de la emergencia de una nueva onda folicular por medio del Estradiol, permite iniciar la SOV sin tener en cuenta el estado del ciclo estral, eliminando la necesidad de detectar celo y esperar 8 a 2 días para administrar el tratamiento con FSH
Gráfico 4
Por lo tanto, este tratamiento permite el desarrollo de un número variable o cohorte de folículos de 3 a 5 mm que crecen al mismo tiempo.
Diversos experimentos demostraron que el BE es el estrógeno que suprime el desarrollo folicular de manera más efectiva y la respuesta SOV es mayor cuando se combina con P4 IM en el mismo momento de la inserción del DIV. La dosis de 2.0 a 2.5 mg de BE, combinado con 50 mg de P4 administrados IM, fueron las dosis más efectivas con un intervalo entre el tratamiento y el comienzo de la nueva onda folicular de 4.0 días. Además con el tratamiento BE+P4 se obtuvo un número similar de embriones transferibles que con el tratamiento de 17β- Estradiol+ P4. El resultado de la utilización del protocolo BE+P4 fue satisfactorio tanto en vacas Bos Taurus como Bos Indicus (MAPLETOFT)
Aunque el número de embriones transferibles no ha aumemtado en relación con las hembras superovuladas entre los 8 a 12 días después del estro, la tas de fertilización en vacas donadoras SOV, después de los tratamientos con estradiol y progestágenos, fué signifcativamente mayor que las vacas control. (BO)
Además, las novillas SOV el día 4 después de la inserción de un DIV de progesterona, sin la administración de estradiol, tuvieron un porcentaje bajo de oocitos fertilizados y embriones transferibles, en comparación con las tratadas con estradiol al momento de insertar el DIV d progesterona. Por el contrario las tratadas con estradiol y progesterona presentan el desarrollo de una nueva onda folicular y en consecuencia un grupo más uniforme de folículos viables con oocitos competentes al omento de ser tratados con FSH. Esto demuestra que los folículos subordinados pueden ser salvados de la atresia, si se hace la aspiración del FD o son tratadas con FSH al momento de la selección del FD. (ADAMS)
La mayoría de los protocolos de sincronización de una nueva onda folicular para SOV comprende la administración de 2.0 -2.5 mg de BE más 50 o 100 mg de progesterona IM al momento de insertar un DIV de P4. Grafico 5.
Las dosis de FSH pueden ser iguales o ser descendentes al igual que el tratamiento convencional para TE en fresco. La PGF2α se aplica en el día 6 AM-PM. El DIV se retira el día 6 PM. La IA se inicia el día 9 AM-PM y el día 10 AM. La recolección de embriones se efectúa el día 16. Tabla 13
Un nuevo protocolo que involucra el empleo de un diluyente de liberación lenta de la FSH. ha aumentado la eficiencia SOV sin que se incremente al producción de embriones. El protocolo utiliza 2 aplicaciones de FSH disuelta en Acido Hialurónico y lo compara con el protocolo convencional de 8 aplicaciones de FSH disueltas en solución salina. La producción de embriones para el protocolo con formulación de liberación lenta fue similar al protocolo tradicional, resaltándose que las hembras necesitan menos manejo, lo cual reduce las labores y el estrés de las donantes. (TRIBULO)
Con el fin de lograr una sincronización de la ovulación y un mayor número de ovulaciones se ha propuesto el protocolo que incluye la administración de eCG, 2 días antes del tratamiento SOV con FSH. Gráfico 6.
En la Tabla 14 se observan los resultados obtenidos con la administración de eCG en el día 2.3 antes de SOV, en donde la administración de eCG en el día 2 tuvo la mejor respuesta tanto de embriones fertilizados como de embriones transferibles. (MENDOZA)
Grágico 7.
Para evitar la necesidad de observar celos en las donadoras se indujo la sincronía de la ovulación mediante el empleo de un protocolo que utiliza un DIV y BE con la administración de pLH (LUTROPIN®) el DIV. 24 horas después de retirar el DIV. Los tratamientos SOV se iniciaron 24 horas después de la ovulación y por lo tanto la emergencia de la primera onda folicular. (BO)
Luego de varios experimentos BO et al, adaptaron un protocolo para IATF en donadoras Bos Taurus, sin la necesidad de detectar celo y sin comprometer las resultados. Gráfico 8.
En este protocolo la emergencia de la onda folicular fue sincronizada con BE y un DIV en el día 0. El tratamiento con FSH se inició el día 4. El día 6 se administró PGF2α AM-PM. En la mañana del día 7, 24 horas después de la administración de PGF2α se retiró el DIV. En la mañana del día 8, 24 horas después del retiro del DIV, se administró pLH o GnRH. La IATF se realizó a las 12 y 24 horas después. El dejar la remoción del DIV para la mañana del día 7 produjo un mayor número de oocitos y embriones fertilizados que al removerlo en la tarde del día 6. Desde el punto de vista práctico la IATF de la donadora ha sido útil en la eliminación de tener que detectar celo. (BO)
Sin embargo BARUSELLI et al confirmaron que era preferible remover el DIV en la tarde del día 7 (P36), enseguida de la administración de pLH o GnRH. Así mismo tuvieron éxito al realizar una sola dosis de IA con semen de muy alta calidad 16 horas después. (BARUSELLI)
Estudios recientes han confirmado que la gran variabilidad individual de respuesta a la SOV está influenciada por el número de folículos presentes en el ovario de la donadora, sin embargo todos los esfuerzos e investigaciones en este sentido no se han reflejado en un mayor número de embriones suministrados por una donadora. (BO)
La necesidad de inyectar dos veces por día, hace que el tratamiento requiera máxima atención y resulta a veces muy difícil de aplicar en algunas explotaciones, reduciendo aún más la posibilidad de su utilización masiva. Además, cuando el tratamiento es aplicado incorrectamente las vacas no responden, o si se las trata bruscamente puede causar estrés en algunas donantes, con la consiguiente disminución de la respuesta SOV.
Con el fin de reducir el estrés de manejo y la influencia que este tiene sobre la respuesta SOV se diseñaron varios experimentos en dode se admiistró una dosis única de FOLLTROPIN®, comparando su efecto con la administración de dos dosis múltiples descendentes. Esta dosis única se diluyo en un agente de liberación lenta, SRF® de Bioniche Anial Health, siendo la dilución de mejor respuesta la del 25% y la dosis de SOV de mejor respuesta de 400 mg de FOLLTROPIN-V®.
En el Día 0, todas las vacas recibieron 5 mg de 17β Estradiol, 50 mg de progesterona y un dispositivo Cue Mate. El Día 4, las vacas fueron SOV con dos tratamientos: las vaas del Grupo Control recibieron Folltropin-V en dosis decrecientes por vía IM cada 12 horas durante 4 días, mientras que las vacas del Grupo Dosis Simple, recibieron una dosis única de Folltropin-V diluida en 10 ml de SRF que fue aplicada por vía IM en la tabla del cuello. En la mañana y la tarde del Día 6, todas la vacas recibieron PGF2α y se retiró el Cue-Mate en la tarde del Dia 6. En la mañana del Dia 8 la vacas reibieron 12.5 mg de pLH y fueron inseminadas 122 y 24 horas más tarde en el Dia 9. Las vacas que mostraron celo en la tarde del Dia 7, fueron inseminadas en el momento de la pLH y 12 horas más tarde. Se recolectaron os embriones en el Día 15 y fueron clasificados siguiendo las normas de la IETS. En el Dia de la recolección, las donantes recibieron PGF2α, para ser nuevamente tratadas entre 13 y 20 dias después (30 a 40 dïas de intervalo entre recolecciones).Este protocolo tuvo una respuesta SOV similar a la obtenida con el protocolo convencional de 8 dosis diarias por 4 días. No hubo efectos adversos del tratamiento sobre crecimiento folicular, el momento de la ovulación y la calidad embrionaria, no obstante siendo viscosa la dilución de SRF empleada, la cual requiere de cuidados especiales. (BO-TRIBULO 2011)
Con el fin de reducir las labores en el tratamiento
superovulatorio mediante la aplicación dos veces al día vía IM de FSH durante 3
a 4 días, HIRAIZUMI et al, investigaron la respuesta SOV en
vacas Japanese Black con una dosis Subcutánea de FSHp en la región del cuello, en
dos dosis diferentes de 20 Unidades Armour (UA), tratamiento 1, y 30 Unidades
Armour (UA), tratamiento 2, disueltas cada una en 10 ml o 50 ml de solución
salina, en comparación con el grupo control que recibieron 20 UA IM dos veces
al día en dosis decrecientes por más de 3 días.
En el tratamiento 1 el promedio de CLs
(15.4 ± 2.5, 18.1 ± 3.4 y 17.2 ± 2.6), el número
total de huevos y embriones (12.9 ± 1.4, 15.9 ± 3.5 y
16.2 ± 2.8), y los embriones transferibles (7.5 ± 2.0, 10.4 ± 2.8 y 8.0 ± 2.1)
no hubo diferencias entre los tratamientos A –B y el control.
En el tratamiento 2 el promedio en el número de CLs (20.5 ± 4.3, 20.4 ± 2.7 y 20.1 ± 3.4),
el número total de huevos y embriones (21.7 ± 4.2,
17.3 ± 3.4 y 16.5 ± 3.2), y embriones transferibles
(8.1 ± 1.6, 9.3 ± 2.2 y 9.5 ± 1.9) no hubo
diferencias entre los tratamientos C y D y el grupo control.
El siguiente protocolo del Gráfico 10, muestra como se puede SOV vacas cada 30 días, sin necesidad de detectar celos y sin comprometer los resultados.
Día 0 - Insertar CIDR + 17β Estradiol 5 mg + 100 mg P4.
Día 4 - Folltropin-V 80 mg dos veces al día IM
Día 5 - Folltropin-V 60 mg dos veces al día IM
Día 6 - Folltropin-V 40 mg IM AM. + PGF2α
Día 6 - Folltropin-V 40 mg IM PM.
Remover CIDR
Día 7 - Folltropin-V 20 mg dos veces al día IMDía 8 - IA - PM
Día 9 - IA - AM
Día 15- Recolección de embriones, congelación o transferencia.
PGF2α
Día 30 - Insertar CIDR + 17β Esrtradiol 5 mg + 100 mg de progesterona. (MAPLETOFT)
Este estudio ha demostrado que el control exógeno del inicio de la onda folicular ofrece la ventaja de poder iniciar los tratamientos SOVs en un momento óptimo para el reclutamiento de folículos, independientemente del estado del ciclo estral. El protocolo es práctico, facil de seguir por el personal de la finca y lo más importante, elimina la necesidad de detectar tanto los celos como la ovulación y la consecuente espera de 8 - 12 días para poder iniciar el tratamiento con gonadotropinas.
En la Tabla 15 se encuentra una hoja de calculo en donde al tomar como base la fecha del día de inicio del protocolo de TE o Día 0, se pueden programar las distintas actividades a realizar, tanto en la donadora como en la receptora. (VEJARANO)
Muestra las distintas labores a realizar durante el protocolo completo de TE en fresco y la sincronización que debe haber entre el inicio del tratamiento de la donadora y la receptora, con IATF para que el útero de la receptora se encuentre en el momento correspondiente a la edad de desarrollo de los embriones a transferir, por lo que el protocolo en la receptora se inicia 2 días antes del protocolo de la donadora y se efectúa el lavado o recolección de embriones en el día 15 del protocolo de TE.
Como vemos hay una gran variedad y multiplicidad de protocolos de SOV para TE, por lo que en la utilización o aplicación de uno u otro juega un gran papel el criterio y la experiencia del profesional.
RECOLECCION DE EMBRIONES
Luego de su fertilización en la ampolla oviductal, los embriones llegan al útero después del día 5, sin embargo, más del 10% puede permanecer en el oviducto al menos hasta el día 8, encontrándose en este día en la punta del cuerno.
El medio de lavado como el de mantenimiento debe semejarse física y químicamente al medio interno del útero al momento de su recolección. El pH debe mantenerse en 7.5± 0.5, co una osmolaridad de 285 a 300 miliosmoles (mMol). Algunos profesionales y Centrales prefieren preparar sus propios medios de lavado y mantenimiento, de acuerdo a la escuela en donde se especializaron, otros utilizan preparados comerciales listos para su administración.
El medio de lavado m´s empleado es el Fosfato Buffer Salino -PBS- Dulbecco, adicionado de Suero fetal Bovino -SFB- inactivado con calor y una solución adecuada de antibióticos/antimicóticos. Igualmente puede emplearse Albúmina Serica Bovina -ASB-. Esta solución debe prepararse y mantenerse congelada en pequeñas dosis individuales, para facilitar su manejo. El medio derecolección contiene de 1 a 2% de SFB y el de mantenimiento normalmente contiene 10% de SFB, pudiendose almacenar en jeringas de almacenamiento, las cuales deben tener émbolos plásticos, pues se ha demostrado que los émbolos de caucho
de las jeringas desechables son tóxicos para los embriones (MAPLETOFT)
En la actualidad se dispone
comercialmente de diferentes medios de
recolección y mantenimiento como TCM-199, HMS F-1, HAM-F10, VIGRO®,
BioLife TM Advantage, Embriocare ®, DMEM
–Dulbecco Modificado Medio Eagle®, etc. Comúnmente, los
embriones son mantenidos en el mismo medio ó uno similar al que fue usado para
la recolección. Algunos de estos medios de recolección, mantenimiento y
congelación no contienen preparados con productos de origen animal y que por lo
tanto no requieren refrigeración, contribuyendo además a mejorar la
bioseguridad.
En
un comienzo la recolección de embriones se efectuó mediante técnica quirúrgica, vía incisión del flanco izquierdo, esta
técnica fue ampliamente utilizada por los profesionales a comienzo de los 80s. Es
de anotar que en Colombia el Dr Gustavo Jaramillo fue el pionero de la técnica de transferencia quirúrgica en
bovinos en el año 1976 y con posterioridad
en la TE no quirúrgica.
Con posterioridad ELSDEN y HASLER, entre otros, desarrollaron el método no quirúrgico mediante el empleo de un catéter de Foley
adaptado para el efecto. Este método evolucionó rápidamente con los trabajos
realizados por la Universidad de Wisconsin y Utrech, utilizando catéteres
siliconados de longitud y tamaño variable.
El
catéter de Rush es de dos vías y tiene un mayor espacio entre la punta y el balón, además de poseer una longitud de 67 cm y un diámetro externo de 14 a 18
cm, cuatro orificios, un espacio entre la punta y el globo de 5.5 cm, y aseguramiento
mediante enroscado. Su extensión permite
que pueda ser utilizado en vacas con diferentes tamaños del útero y que puedan
ser introducidos a distancias distintas
dentro del cuerno uterino. Sin embargo, hay variedad de proveedores de equipos
que suministran otro tipo de catéteres que son modificaciones del catéter de
Rush. Actualmente es la técnica empleada por todos los Profesionales de Reproducción
Asistida, dada su facilidad de ejecución.
Existe
una gran variedad de técnicas de lavado con porcentajes de éxito comparables.
Como requisito previo debe realizarse una anestesia epidural baja, con la
administración de 2 a 3 ml de lidocaína o xiloxaina al 2%.
La inyección debe aplicarse lentamente y sin
resistencia. A pesar que la relajación de la cola es inmediata, la acción sobre
el recto y el esfínter del ano requiere aproximadamente 10 minutos.
Por otra
parte puede producirse un efecto anestésico incompleto, con una buena anestesia
de la cola (flaccidez) pero insuficiente anestesia de los órganos de internos,
causado por lo general por una incorrecta administración. En ese caso deberá
suplementarse o repetirse la dosis.
Es importante
destacar que una insuficiente anestesia epidural puede
ocasionar el fracaso del lavaje en animales indóciles, en estos casos se
recomienda la administración controlada de tranquilizantes como la Ketamina o
la Xilacina.
En algunos casos es
posible la aspiración de aire dentro del recto, lo que constituye una
complicación pues este pierde sensibilidad y capacidad de expulsión del aire,
para solucionar este inconveniente se puede hacer retracción suave del útero al
momento de efectuar la evacuación de la materia fecal.
La
técnica de lavado y recolección de embriones consiste en la introducción del
catéter, con un estilete acerado que le
da la rigidez necesaria para su paso a través del cérvix, colocándo la punta del mismo en la parte media de cada cuerno o aún más adentro, con el fin de efectuar el lavado individual de cada uno.
Los
puntos de referencia para el avance del catéter son el ligamento intercornual,
la curvatura uterina y el extremo anterior del cuerno. Una vez se alcanza la
posición deseada se retira el mandril y se procede a insuflar el balón con aire
o medio. El volumen depende de la edad y tamaño del animal, siendo el operador
quien determine finalmente por palpación la cantidad a administrar.
Si
el balón se encuentra en el extremo anterior del cuerno y este no se distiende
al inyectar la solución, significa que la pared del útero se desgarró o fue
perforada con la punta del catéter, el medio es expulsado en la cavidad
abdominal, recuperándose solo un volumen reducido teñido de sangre.
Existen dos sistemas de lavado o recolección de embriones, el de flujo
continuo, con un sistema de circuito cerrado y la recolección interrumpida la cual se
realiza con jeringa.Cada técnica tiene sus ventajas y desventajas,
pudiéndose combinar ambas técnicas por parte del profesional, según su criterio
y experiencia.
En
el flujo continuo el medio de lavado se introduce dentro del útero por gravedad.
Otros utilizan un sistema de
circuito cerrado de tres vías y jeringas que facilitan la introducción de
pequeños volúmenes de medio.
El medio con los embriones son recolectados en filtros que permiten su separación a medida que fluye el
medio de lavado, equipos que son desechables. Hay una amplia gama de filtros que permiten el paso del medio, mientras quedan atrapados los
oocitos y embriones dentro del mismo y se desecha el medio sobrante.
El sistema de jeringa permite la introducción de una pequeña cantidad de medio que produce un torbellino interno, con lo que se movilizan los embriones, siendo luego extraído con la misma jeringa de manera alterna y posteriormente pasarlo por los filtros para su separación y posterior clasificación. Una vez terminado el lavado se repite la misma operación en el otro cuerno. De acuerdo a la flexibilidad del catéter es posible cambiarlo de cuerno sin sacarlo del tracto genital, para lo cual luego de desinflar el balón, se retira hasta el cérvix con el fin de introducir lentamente el mandril para luego ser dirigido al otro cuerno.
Una
guía para determinar la cantidad de embriones posibles de recuperar, es la de
contar el número de CLs presentes en
cada ovario, ya que correspondería con el número de ovulaciones. Sin embargo no
siempre sucede esto y la razón no se
conoce con exactitud, dándose algunas explicaciones como oocitos no
fertilizados, embriones retardados o degenerados que quedan atrapados en el
oviducto o ser reabsorbidos, falta de experiencia o problemas de lavado aún en
grupos experimentados.
La evaluación de
los embriones debe realizarse mediante examen microscópico de la caja de Petri sobre una base
cuadriculada, que facilita la observación ordenada con aumentos de 50 – 100 X.
Todas las
estructuras encontradas son trasferidas a otra caja para su selección
individual y conformar un grupo final para clasificación.
Cada uno de los
embriones es colocado en cajas de selección y almacenamiento. Aunque los
embriones son trasferidos luego de su selección, es posible conservarlos por
algunas horas a temperatura ambiente en el medio de mantenimiento, el cual es
más enriquecido que el de recolección.
Los puntos a tener en cuenta al evaluar los embriones son:
ESFERIFICIDAD.- La
estructura es esférica, cualquier variación se considera una colapso y por
consiguiente de menor calidad.
ESTRUCTURAS
VISIBLES.- En sus estados iniciales las blastomeras son bien definidas,
mientras que a medida que son más numerosas son menos diferenciables debido a
la aglomeración de las mismas.
REGULARIDAD.- Se
aprecian estructuras bien definidas sin deformaciones que indiquen su degeneración o muerte.
OPACIDAD.- Los
embriones viables poseen refringencia, los degenerados son opacos y en su
mayoría son siempre oocitos. La refringencia del embrión es debida a la
brillantez de la membrana plasmática del embrión.
ZONA PELUCIDA INTACTA - ZP.- La ZP no debe presentar fracturas, desgarros o soluciones de continuidad, así como erosión de su superficie, esto último es indicativo de lesión bacterial.
El diámetro
promedio del embrión bovino es de 150 – 190 µm, incluyendo el espesor de la ZP
de 12 a 15 µm. Este permanece sin cambios desde el estado de una célula hasta
el estado de Blastocisto.
El embrión ideal
debe ser compacto y esférico. Las blastómeras deben tener tamaño, color y apariencia
similares, con un contorno uniforme. La ZP debe ser uniforme, no debe tener
fisuras ni estar colapsada y no presentar detritus celulares en su superficie.
El contenido del embrión debe ser fijo. El citoplasma no debe estar granulado o tener
vesículas. El espacio perivitelino, el cual es el espacio existente entre el
embrión y la ZP, debe estar limpio y no
contener residuos celulares.
ESTADOS DE DESARROLLO EMBRIONARIO
MORULA TEMPRANA.-
Masa de al menos 16 blastómeras
individuales difíciles de distinguir una de la otra, la cual ocupa la mayor
parte del espacio perivitelino.
MORULA COMPACTA.-
Blastometras
agrupadas formando una masa compacta que ocupa el 60 – 70% del espacio
perivitelino.
BLASTOCISTO TEMPRANO.- Las blastómeras organizadas se distienden formando un anillo con una cavidad o blastocele para ocupar el 60 -70% del espacio perivitelino
BLASTOCISTO.-Dentro
de la ZP se observan cambios bien diferenciados de la capa externa del embrión
o Trofoblasto y la Masa Celular Interna,
más oscura y compacta. El blastocele es más notorio y el embrión ocupa casi
todo el espacio perivitelino.
BLASTOCISTO TARDIO
O EXPANDIDO.- El diámetro general del
embrión aumenta notoriamente, mientras se aprecia un gran adelgazamiento de la
ZP.
BLASTOCISTO
ECLOSIONADO.-
Los embriones en
este estado inician la perdida de la ZP, la cual se rompe y permite la
extrusión del embrión, por lo que se puede observar la salida del mismo por la
ruptura dejándolo completamente libre, siendo evidente la delimitación del Blastocele
y la Masa Celular Interna MCI, o pueden
estar colapsados. Su identificación puede ser difícil a menos que se re
-expandan.
EXCELENTE.- Embrión esférico simétrico, con células de tamaño color y apariencia uniforme, contenido embrionario fijo y ZP intacta.
BUENO: Presentan
pequeñas imperfecciones como blastómeras extruidas, de menor tamaño, forma
irregular con algunas vesículas.
REGULAR: Los
defectos son más definidos, con blastómeras extruidas, vesículas y células
degeneradas.
MALO: Las
blastómeras extruidas son numerosas así como las células degeneradas de
diferentes tamaños, vesículas grandes y numerosas, aunque aparentemente se ve
una masa embrionable viable. Generalmente no son de calidad trasferible.
CODIGOS DE CALIDAD
RECOMENDADOS
Los códigos
establecidos por la IETS para clasificar embriones se encuentran entre “1 a 4”.
Código 1.- Excelente o bueno. Embriones simétricos y esféricos, con masa embrionaria constituida por
blastómeras de tamaño, color y densidad uniforme. Se encuentran en estado
correspondiente al de la edad de recolección. Se pueden observar
irregularidades menores con al menos el 85% de masa celular viable e intacta.
El material extruido en el espacio perivitelino no mayor del 10%. La ZP debe
ser lisa y no presentar superficies cóncavas o planas que puede ocasionar que
el embrión se adhiera a las pajillas o cajas de Petri.
Código 2.- Regular. Alteraciones moderadas en la forma, tamaño, color y densidad de la masa
embrionaria y de las células individuales. Al menos el 50% de la masa
embrionaria debe ser viable e intacta.
Codigo 3.- Malo.
Marcas irregulares en la masa embrionaria, tamaño, color y densidad de las
células. Un 25% de la masa embrionaria viable e intacta.
Código 4.-
Degenerado. Embriones con masa indefinida o colapsada.
Estos embriones
junto con los oocitos no son viables para trasferencia.
El manual de
En una misma recolección es posible encontrar una considerable variedad de estados de desarrollo embrionario en un momento determinado. El día 7 después de l IA pueden encontrarse mórulas y blastocitos en eclosión. Al mismo tiempo, se pueden encontrar embriones de excelente calidad y embriones no fertilizados y degenerados. El hecho de encontrar grandes variaciones en la calidad y el estado de desarrollo embrionario generalmente indica que los embriones con apariencia normal pueden estar sujetos a estrés ó alterados y por consiguiente los índices de preñez no son satisfactorios. Los embriones de excelente y buena calidad, en estados de desarrollo de mórula compacta a blastocito producen índices de preñez más altos, aún después de haber sido congelados. Los embriones regulares, de baja calidad o malos producen índices de preñez bajos después de congelados, por lo que deben ser transferidos en fresco. Es recomendable escoger el estado de desarrollo del embrión acorde con la sincronía de la receptora. Los embriones clasificados como regulares o pobres tienen mayor posibilidad de sobrevivir si son trasferidos a las receptoras con mejor sincronía.
Una vez
seleccionados los embriones a trasferir se deben efectuar varios lavados, con
el fin de eliminar moco o células
adheridas a la ZP, de tal manera que se aíslen en un estado de limpieza óptimo.
Para el efecto se
realiza la siguiente serie de lavados:
5 lavados con PBS
(1/100 volumen de los embriones y no más de 10 embriones).
2 lavados con tripsina al 0.2% por 30
a 60 segundos.
5 lavados con PBS.
Luego de llevar a
cabo los lavados, se procede al empacado del embrión en la pajilla de
transferencia o congelación según el caso. Al efecto se coloca la pajilla en el
catéter por el extremo con el tapón blanco hacia abajo y se coloca el
dispositivo para facilitar la aspiración del embrión y se colocan en la
gradilla según el número de embriones a transferir.
TRANSFERENCIA DEL EMBRION
Las primeras trasferencias en los años 70s se llevaron a cabo por el método quirúrgico,
mediante incisión de la fosa paralumbar correspondiente al mismo lado en que se
encuentra el CL, identificado con anterioridad. Se exponía la punta del cuerno
uterino a través de la incisión y se puncionaba la pared del útero con un
estilete romo. El embrión previamente seleccionado y aspirado en una pipeta
Pasteur o catéter N° 20, unido a una jeringa de 1 ml, se depositaba en la punta del cuerno a través de la punción
previamente realizada. (HASLER)
Actualmente la TE se efectúa
por la técnica no quirúrgica
Con la hembra asegurada en el brete, se
procede al lavado y desinfección del tren posterior y los genitales externos.
Luego se aplica una anestesia epidural baja, con el fin de relajar el cuello y
facilitar la introducción del catéter. Enseguida se arma la pistola con la
pajilla del embrión a transferir.
El catéter se introduce en la vagina, de
la misma manera a como se procede en la IA, hasta llegar a la parte anterior del cuerno
uterino, para dirigirlo posteriormente a la punta del cuerno ipsilateral al CL, previamente identificado.
SINCRONIZACION DONADORA
RECEPTORA
Desde la iniciación
del TE se ha hecho énfasis en la
necesidad de lograr una sincronización entre la edad cíclica del útero de la receptora con la edad de
desarrollo del embrión, tanto para su transferencia en fresco como de embriones congelados.
Con el manejo del
ciclo estral, mediante protocolos hormonales para IATF se ha conseguido este
objetivo, sin embargo hay dos tendencias bien
definidas.
La primera,
considerada tradicional, consiste en detectar el celo de un grupo de receptoras y utilizar aquellas que
presentan celo con una diferencia
de ± 1 día con el celo de referencia de la donadora e inicio del protocolo
elegido de TE.
En la Tabla 16 se presenta los resultados relacionados por
el Dr. Gabriel Velez junto con otros profesionales, que dan una idea y pueden
servir de guía a seguir en el ejercicio de la Reproducción Asistida.
Las receptoras
sincronizadas con PGF2µ deben tratarse 12 a 24 horas antes de la donadora, ya
que la PGF2µ induce la presentación del celo 60 a 72 horas de su aplicación. (KASTELIC)
El éxito de los programas de sincronización de celos depende del entendimiento de las siguientes áreas:
1.- La fisiología del ciclo estral bovino (descrito anteriormente),
2.- Agentes farmacológicos y sus efectos sobre el ciclo estral de las vacas.
3.- Factores de manejo del rebaño que puedan reducir el anestro e incrementar las tasas de concepción. (MAPLETOF)
Un primer factor de selección de la receptora es el día de transferencia a la receptora.
En el Gráfico 12 se aprecia que los porcentajes de
concepción en los días 7-8-9 corresponden al 47%- 55% y 43% respectivamente. Es
claro que el mejor día para efectuar la transferencia de los embriones es el día 8 con una preñez
del 80% de las receptoras y un porcentaje de concepciones del 55% en este día.
Este dato es importante cuando se manejan volúmenes altos de hembras. (VELEZ)
Un segundo factor
de selección al momento de la transferencia es la presencia y el tamaño del CL en la receptora. Hay que considerar que en los primeros 7 días del ciclo estral el tamaño del CL puede aumentar de 9.4 mm a 21.9 mm y que con esto aumenta la tasa de concepción.Según Oyuela 2009 el porcentaje de preñez para CL en
tres Centrales de Asistencia Reproductiva fueron de 28% para CL1 39% para CL2 y
CL3. Gráfico 13
Lo anterior ha sido corroborado por
otros trabajos (BARUSELLI – SPELL) y de hecho, el tamaño del CL y la
concentración de P4 al momento de la TE es una variable considerada
determinante para el establecimiento de la preñez. Por esta razón, la medición
del CL es un parámetro de selección de las receptoras.
Al mismo tiempo que se determina el
tamaño del CL mediante palpación y
ecografía, se determina el ovario en que
se encuentra, ya sea el derecho o el izquierdo, lo cual es importante para que
al momento de realizar la transferencia esta se efectúe en el cuerno
ipsilateral al CL del ovario de la receptora.
De otra parte hay que tener en
cuenta que al momento de seleccionar las receptoras el día de la transferencia se presenta una gran variación en cuanto a su clasificación como
aptas y no aptas. Según VELEZ un 25% de las receptoras sincronizadas no se van
a poder utilizar en la transferencia.
La
administración de complejos vitamínicos
y minerales en las
receptoras dentro de un programa de
mejoramiento y preparación del grupo de
receptoras previo a su inclusión en
protocolos de TE, aumenta la capacidad y
el porcentaje de pegamiento de embriones.
Dentro
de los productos comerciales se encuentran el Kirofosfan®, Betaferol®,
Calfosvit®
Debido a la implementación de los protocolos de IATF en la TE, se ha podido adelantar la Trasferencia de Embriones a Tiempo Fijo TETF, en donde es posible eliminar la necesidad de detectar celos en las receptoras, protocolos que fueron expuestos anteriormente
CONGELACION DE EMBRIONES
La congelación de embriones es una
técnica que se aplica cuando hay disponibilidad de embriones de excelente
calidad que no son trasferidos en fresco
y pueden aprovecharse en procesos posteriores. Su objeto es la reducir los
procesos metabólicos del embrión a su mínima expresión y se puedan conservar el
mayor tiempo posible y garantizar que en el momento de su utilización luego de
la descongelación conserven su viabilidad y por lo tanto lleguen a terminar en
una gestación.
La congelación de las células vivas es
un proceso fisico - quimico complejo de intercambio de agua entre la célula y
el medio que la rodea, existiendo un índice de enfriamiento óptimo para cada
tipo de células, lo cual depende del tamaño de la célula, el radio entre su superficie y su volumen, su permeabilidad
al agua y el coeficiente de temperatura
de esa permeabilidad. (PALASZ)
Normalmente, el medio que contiene los embriones se enfría por debajo de su punto de congelación sin formar cristales de hielo, fenómeno conocido como súper-enfriamiento. Luego, a una temperatura más baja, ocurre la formación de núcleos de hielo, seguida por un rápido incremento en la temperatura debido a la liberación del calor de fusión latente. Para evitar un superenfriamiento muy extenso, se debe inducir la cristalización del hielo en el medio extracelular más ó menos a
Las células se dañan durante los procesos de congelación y descongelación principalmente por los efectos de la solución y la formación de hielo intracelular. Esto último, es especialmente dañino cuando se forman cantidades relativamente abundantes de cristales grandes.
Para
asegurar la supervivencia del embrión luego de la congelación, se requiere la
adición de crioprotectores los cuales
actúan reduciendo la cantidad de hielo presente a una temperatura determinada
durante la congelación, moderando así los cambios en la concentración de
solutos. Los criterios que debe cumplir un crioprotector son: tener alta
solubilidad, baja toxicidad a altas concentraciones, y bajo peso molecular,
tanto para facilitar la permeabilidad como para ejercer un efecto de unión
máximo. Durante la adición y dilución del
criprotector, la célula sufrirá cambios osmóticos que conducen a la
expansión o contracción de la misma. Como resultado, si la adición o,
particularmente la dilución, se lleva a cabo de manera inapropiada, la
viabilidad de las células puede verse afectada.
En la actualidad se prefiere utilizar
el etilenglicol con crioprotector, ya que no necesita ser removido del embrión
antes de la trasferencia como sucede con el glicerol utilizado en un principio.
Los embriones seleccionados son colocados en el medio de congelación a base
de PBS suplementado con SFB al 10-20% y 1.0 a 1.5 M de etilenglicol, a
temperatura ambiente (20°C), dejándolos por 8 a 10 minutos para permitir que el
crioprotector se equilibre dentro de las células embrionarias. Durante este
período de equilibrio se empacan los embriones en pajillas francesas de 0.25 a
o.5 ml, las cuales se sellan.
A partir de 2009 más del 99% de los
embriones de vacas de carne y leche en los Estados Unidos han sido congelados
en Etilen Glicol por la American Embryo Transfer Association (AETA) para una
Trasferencia Directa TD.
Una vez empacadas se colocan
inmediatamente en la cámara del congelador a una temperatura de -6 a -7°C,
donde se dejan por 5 minutos, en vapores de nitrógeno.
Luego se induce la cristalización del
hielo en el medio extracelular o “seeding” mediante la aplicación de una pinza
hemostática o un topito de algodón preenfriado en el nitrógeno líquido, tocando
la pared exterior de la pajilla, teniendo cuidado de no tocar la columna del
medio que contiene el embrión. Debe observarse una mancha blanca por debajo del menisco donde se aplicó la
pinza, lo que confirma que el proceso de cristalización se ha llevado
correctamente.
Se recomienda que el proceso de
cristalización se realice individualmente y no en conjunto de la totalidad de
los embriones a congelar. La técnica correcta es empacar un embrión, colocarlo en la criocámara e
inmediatamente realizar la cristalización de la pajilla en forma individual. Se deben mantener las pajillas a esta
temperatura por 10 minutos más para permitir que la cristalización del medio
alcance su equilibrio. Luego se enfrían
los embriones a una tasa de 0.3 a 0.8 °C/min hasta
alcanzar una temperatura de entre -30 y -40°C , y enseguida colocan las pajillas en una cánula plástica para después ser depositadas en un gobelet
y sumergidas posteriormente en nitrógeno líquido a -196°C dentro de un termo para su almacenamiento. (MAPLETOF)
La
descongelación de los embriones se realiza colocando las pajillas dentro de un
recipiente de agua tibia con temperatura entre 20 Y 35°C. Se ha demostrado que se redujo la incidencia de fracturas en
la ZP cuando las pajillas eran descongeladas exponiéndolas solamente al aire, o cuando se descongelaban exponiéndolas primero al aire por 10-15 segundos para
luego llevarlas al baño maría a 35°C .
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